Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis unter eisenbeschränkten Bedingungen

Zusammenfassung

Quelle: Gupta, S., et al. Isolierung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel, die von eisenlimitierten Mykobakterien produziert werden. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Kultivierung von Mycobacterium tuberculosis unter eisenbeschränkten Bedingungen, um Eisenstress zu induzieren und die Sekretion von Siderophoren zu fördern, die das Überleben der Bakterien unterstützen.

Protokoll

1. Anbau von Mykobakterien unter eisenarmen Bedingungen

1. Tauen Sie 50 μl eines gefrorenen 15%igen Glycerinbestands an Mtb (Mycobacterium tuberculosis) auf und streichen Sie eine Agarplatte, die mit einer Anreicherung von 10 % ADN (Albumin – Dextrose – NaCl) ergänzt wird (5 g/l Albumin, 2 g/l Dextrose und 0,85 g/l Natriumchlorid, 0,2 % Glycerin und 0,05 % Tween-80). Die Platte bei 37 °C inkubieren, bis die Kolonien sichtbar sind.
2. Eine einzelne Mtb-Kolonie wird in 2 ml mykobakterieller Bouillonmedium (Materialtabelle) geimpft, ergänzt durch ADN-Anreicherung. Unter Rühren bei 37 °C inkubieren.
3. Lassen Sie die Mtb-Kultur bis zur späten logarithmischen Phase wachsen (OD₅₄₀ ist ~0,8). Um dies zu überprüfen, messen Sie den OD₅₄₀ mit einem Spektralphotometer.
4. Verteilen Sie 200 μl der spätlogarithmischen Kultur auf die mykobakteriellen Agarplatten (Materialtabelle), ergänzt mit 0,2 % Glycerin, 0,05 % Tween-80 und ADN. Impfen Sie mindestens 5 Platten. Die Platten werden bei 37 °C inkubiert, bis das Bakterienwachstum als konfluente Schicht sichtbar ist. Dies dauert ~1 Woche für Mtb.
5. Befeuchten Sie ein steriles Wattestäbchen mit LIMM (eisenarmes Minimum Medium). Verwenden Sie diesen Tupfer, um Bakterien von den Agarplatten zu sammeln und 100 ml LIMM zu impfen, um eine konzentrierte Bakteriensuspension mit einem OD₅₄₀ von ~1,0 herzustellen.
6. Verdünnen Sie diese Suspension 10-mal auf 1 l mit LIMM und teilen Sie sie in zwei sterile 2-Liter-Plastikflaschen auf, die jeweils 500 ml Kultur enthalten.
7. Nehmen Sie 2 mL Kultur heraus und geben Sie sie in ein 5 mL Kulturröhrchen. 10 μl 10 % vol/vol Tyloxapol zugeben.
8. Inkubieren Sie die Kulturen 14 Tage lang bei 37 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	Mykobakterielle Agarplatten
Middlebrook 7H9 Brühe	BD Difco	271310	Mykobakterielles Bouillon Medium
Polypropylen dünnwandiges Zentrifugenröhrchen 13x15 mm	Beckman Coulter	344059	Polypropylen dünnwandiges Zentrifugenröhrchen 13x15 mm
Vakuum-Filtrationskolben	CellPro	Nr. V50022	Filtereinheit