Isolierung von siderophorhaltigen extrazellulären Vesikeln aus Mycobacterium tuberculosis

Zusammenfassung

Quelle: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolierung und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel, die von eisenbegrenzten Mykobakterien produziert werden. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die schrittweise Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Mycobacterium tuberculosis , die unter eisenlimitierenden Bedingungen kultiviert wurden, die die Wirtsumgebung nachahmen. Es wird der Einsatz von Ultrafiltration, Differenzialzentrifugation und Dichtegradiententrennung zur Anreicherung und Identifizierung von EV-haltigen Fraktionen beschrieben.

Protokoll

1. Entnahme von mykobakteriellen extrazellulären Vesikeln (MEVs)

1. Messen Sie den OD₅₄₀ der 2-ml-Kultur zum Zeitpunkt der Entnahme. Führen Sie 1:10 serielle Verdünnungen der Kultur durch und platten Sie 100 μl jeder Verdünnung auf Agarplatten mit ADN und 0,05 % Tween-80.
2. Die Kultur in fünf konische 225-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und bei 2.850 x g für 7 min bei 20 °C zentrifugieren.
3. Sammeln Sie den Kulturüberstand mit einer 50-ml-Pipette und sterilisieren Sie ihn durch eine 0,22-μm-Filtereinheit.

2. Isolierung von MEVs

1. Übertragen Sie das Kulturfiltrat in ein gerührtes Zell-Ultrafiltrationssystem, das bei 4 °C platziert ist, und filtrieren Sie das Konzentrat bei <50 psi durch eine 100 kDa-Cutoff-Membran auf ~50 mL.
2. Das konzentrierte Kulturfiltrat bei 15.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand auffangen.
3. Zentrifugieren Sie das Kulturfiltrat in Polycarbonat-Ultrazentrifugationsröhrchen bei 100.000 x g für 2 h bei 4 °C.
4. Resuspendieren Sie die membranösen Pellets in insgesamt 1 mL steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch schonendes Pipettieren.
5. Mischen Sie 0,5 ml der in Schritt 2.4 erhaltenen Pelletsuspension mit 1,5 ml 60%iger Iodixanollösung, wodurch eine endgültige Iodixanolkonzentration von 45 Gew.-% / vol erreicht wird. Geben Sie diese Mischung auf den Boden eines dünnwandigen Ultrazentrifugenröhrchens aus 13 mm x 51 mm Polypropylen.
6. Überlagern Sie die MEV-Iodixanol-45%-Suspension mit 1 ml 40 %, 35 %, 30 %, 25 % und 20 % (vol/vol in PBS) Iodixanol-Lösungen und 1 ml PBS an der Oberseite.
7. Zentrifugieren bei 100.000 x g für 18 h bei 4 °C.
8. Sammeln Sie die 1 mL Dichtegradientenfraktionen beginnend von oben mit einer 1 mL Hamilton Spritze.
9. Jede gesammelte Fraktion wird auf 20 mL mit PBS verdünnt und 2 h bei 4 °C bei 100.000 x g zentrifugiert.
10. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 0,5 ml PBS. Lagern Sie dieses Pellet bei 4 °C.

Materialien