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1. Bakterienstämme und Kultivierungsbedingungen
ANMERKUNG: Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme waren Escherichia coli MP1, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve und Bifidobacterium dentium.
1. Für E. coli verwenden Sie eine sterile Schlaufe, um einzelne Kolonien in 250 bis 1.000 ml Luria-Bertani (LB)-Bouillon zu impfen und inkubieren Sie aerob in einem Schüttelinkubator bei 300 U/min und 37 °C für 48 Stunden, bevor Sie die Kultur verarbeiten. Für den rekombinanten E. coli MP1-Stamm mit p114-mCherryClyluc fügen Sie dem LB-Agar und der Brühe Chloramphenicol in einer Endkonzentration von 17 μg/ml hinzu.
2. Für A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve und B. dentium auf Agarplatten der Gehirn-Herz-Infusion (BHI) streifen und anaerob in einer anaeroben Vinylkammer inkubieren. Einzelne Kolonien in 100 ml vorreduzierte BHI-Bouillon impfen und 48 h anaerob inkubieren.
2. Isolierung von Elektrofahrzeugen
1. Klärung des Bakterienkulturmediums durch Zentrifugation und Filtration
1. Übertragen Sie die in Schritt 1 geimpften Bakterienzellkulturen, um 250 mL oder 500 mL Polypropylen-Zentrifugenflaschen durch Ausgießen zu reinigen. Zentrifugieren Sie die Flaschen in einem Festwinkelrotor mit großem Fassungsvermögen bei 4 °C und 5.000 × g für 15 min. Den Überstand durch vorsichtiges Aufgießen in saubere Zentrifugenflaschen überführen und erneut bei 10.000 × g für 15 min zentrifugieren.
ANMERKUNG: Verwenden Sie die Flaschen nach einer biosicherheitsgerechten Reinigung und Dekontamination wieder.
1. Wenn nach der zweiten Zentrifugation große Pellets von Bakterienzellen vorhanden sind, wiederholen Sie die Zentrifugation in einer sauberen Flasche, um die Zellen weiter zu entfernen.
2. Der Überstand wird durch Gießen in eine 0,22 μm vakuumbetriebene Polyethersulfon-Filtervorrichtung geeigneter Größe überführt. Filtern Sie, indem Sie das Filtergerät an eine Vakuumwandversorgung anschließen. Wenn die Filtrationsrate erheblich sinkt, füllen Sie das ungefilterte Material einfach in ein neues Gerät um. Lagern Sie das gefilterte Medium über Nacht bei 4 °C und setzen Sie das Protokoll auf Wunsch am nächsten Tag fort.
ANMERKUNG: Die oben genannten Zentrifugen ermöglichen in der Regel die Verarbeitung von ~2x des angegebenen Zellkulturvolumens durch jedes Gerät. Zum Beispiel könnte ein einzelnes 500-ml-Filtergerät ~1.000 mL vorzentrifugierter Kultur filtrieren. Diese Geräte werden in der Regel nicht wiederverwendet. Der Einsatz von Spritzenvorsatzfiltern ist in diesem Schritt ohne Optimierung nicht zu empfehlen, da bei den getesteten Modellen erhebliche Verluste festgestellt wurden. Dies ist ein potenzieller Haltepunkt.
3. Zu diesem Zeitpunkt ist zu prüfen, ob die lebensfähigen Zellen vollständig entfernt wurden, indem ein Aliquot des filtrierten Überstands auf geeignete Agarplatten aufgetragen wird, und sicherzustellen, dass nach der Inkubation unter optimalen Bedingungen für den Bakterienstamm keine Kolonien vorhanden sind. Wenn Bakterien nachgewiesen werden, optimieren Sie das oben beschriebene Verfahren weiter, indem Sie zusätzliche Zentrifugationen und/oder Filtrationen durchführen.
2. Konzentration des gefilterten Mediums
1. Wenn Sie mit Volumina arbeiten, die erheblich >100 ml betragen, fahren Sie mit Schritt 2.2.2 fort. Wenn Sie mit Volumina von ~100 mL arbeiten, laden Sie 90 mL gefiltertes Kulturmedium mit serologischen Pipetten auf das Reservoir einer Zentrifugal-Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer Kapazität von 100 kDa mit einem Molekulargewichtsgrenzwert (MWCO) mit entsprechender Kapazität. Balancieren Sie immer mit einem passenden Ultrafiltrationsgerät und zentrifugieren Sie in einem schwingenden Schaufelrotor bei 4 °C und 2.000 × g in Intervallen von 15 bis 30 Minuten, bis das Volumen des Mediums im oberen Reservoir auf <0,5 ml konzentriert ist.
1. Füllen Sie das Reservoir mit dem restlichen gefilterten Nährmedium auf. Wenn Sie "aufladen", entfernen Sie den Durchfluss an der Unterseite des Geräts und gleichen Sie alle Geräte wieder aus.
ANMERKUNG: Es wurde beobachtet, dass das maximale Volumen des gefilterten Kulturmediums, das mit diesen Geräten konzentriert werden kann, das <2-fache des empfohlenen Volumens beträgt.
2. Wenn die Viskosität des konzentrierten Mediums im Reservoir sichtbar erhöht ist (dunkles, viskoses Material), wird es mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und durch Zentrifugation erneut konzentriert, um alle Nicht-EV-Proteine zu verdünnen, die kleiner als der MWCO von 100 kDa sind.
ANMERKUNG: Dies ist ein potenzieller Haltepunkt.
3. Übertragen Sie das konzentrierte Medium in ein Röhrchen mit geringer Proteinbindung, lagern Sie es über Nacht bei 4 °C und setzen Sie das Protokoll am nächsten Tag fort, falls gewünscht.
2. Wenn Sie mit Volumina arbeiten, die erheblich >100 ml betragen, wählen Sie ein TFF-Gerät (Tangentialflussfiltration) (100 kDa MWCO) in geeigneter Größe, um das zu verarbeitende Volumen aufzunehmen.
ANMERKUNG: Filtrationsgeräte für die Verarbeitung von 100 mL bis >1.000 mL sind im Handel erhältlich. Die lokale Verfügbarkeit, die Kosten und die Kompatibilität mit der Pumpe und den Schläuchen/Anschlüssen bestimmen, welche Modelle am nützlichsten sind. Bis zu 2 l Kulturmedium wurden mit dem in der Materialtabelle angegebenen Gerät verarbeitet, bevor der Filter gereinigt werden musste (siehe Schritt 2.3 unten für das Reinigungsprotokoll).
1. Montieren Sie einen Filtrationskreislauf mit #16 Schlauch mit geringer Bindung/geringer Auslaugung, 1/8-Zoll-Schlauchtülle auf Luer-Adapter, dem TFF-Gerät und einer Schlauchpumpe.
ANMERKUNG: Führen Sie TFF in einer Biosicherheitswerkbank durch, um das Risiko einer Kontamination der EV-Vorbereitung mit Umweltbakterien zu minimieren.
2. Beginnen Sie bei Raumtemperatur mit der Zirkulation des gefilterten, konditionierten Mediums bei ca. 200 mL/min (mindestens 100 mL/min). Bestimmen Sie die geeignete Drehzahl, die der gewünschten Durchflussrate entspricht, indem Sie 200 mL PBS in ein Messgefäß pumpen. Beim Zirkulieren von gefiltertem, konditioniertem Medium sind die Moleküle <100 kDa, die die Ultrafiltrationsmembran passieren, als Abfall in einem separaten Behälter zu sammeln.
ANMERKUNG: Im folgenden Beispiel wird von einem Startvolumen von 2 l Kultur ausgegangen.
3. Zirkulieren Sie das konditionierte Medium weiter, bis sein Volumen auf ~ 100-200 ml reduziert wurde. Wechseln Sie bei Bedarf zu kleineren Schiffen. Verdünnen Sie 2-fach mit PBS und zirkulieren Sie weiter mit der Pumpe, wobei Sie sich auf 75-100 mL konzentrieren. 2-fach mit PBS verdünnen und weiter zirkulieren bis zu einem Endvolumen von 25 ml. 2-fach mit PBS verdünnen und bis <10 ml weiter zirkulieren lassen.
4. Heben Sie den Zuführschlauch aus dem Probenbehälter und pumpen Sie weiter, um den Filter zu spülen und die maximale Probenmenge zu gewinnen.
ANMERKUNG: Dies ist ein potenzieller Haltepunkt.
5. Die konzentrierte Probe wird in ein konisches Röhrchen umgefüllt und über Nacht bei 4 °C gelagert, falls gewünscht. Alternativ können Sie mit dem Protokoll fortfahren.
6. Bringen Sie die konzentrierte Probe in ein 100-kDa-MWCO-Zentrifugal-Ultrafiltrationsgerät mit einer Kapazität von 15 mL. In einem schwingenden Schaufelrotor bei 4 °C und 2.000 × g für Intervalle von 15 bis 30 Minuten zentrifugieren, bis das Volumen des Mediums im oberen Reservoir auf <2 ml konzentriert ist.
ANMERKUNG: Dies ist ein potenzieller Haltepunkt.
7. Füllen Sie das konzentrierte Medium in ein Röhrchen mit geringer Proteinbindung und lagern Sie es über Nacht bei 4 °C, wobei Sie das Protokoll auf Wunsch am nächsten Tag fortsetzen können.