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1. Größenausschlusschromatographie (SEC)
ANMERKUNG: SEC wird verwendet, um die Reinheit von extrazellulären Vesikeln (EVs) zu erhöhen und nicht-vesikuläres Protein zu entfernen.
- Verwenden Sie eine kleine SEC-Säule (10 mL Bettvolumen) für die Isolierung von EVs aus <100 mL Ausgangsmaterial und eine größere Säule (47 mL Bettvolumen) für die Isolierung von EVs aus >100 mL Ausgangsmaterial.
ANMERKUNG: Im folgenden Beispiel werden die Volumina für die größere Spalte aufgelistet, wobei die Volumina für die kleinere Spalte in Klammern stehen. - Bringen Sie die SEC-Säule und die phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) über mehrere Stunden auf Raumtemperatur. Stabilisieren Sie die SEC-Säule in vertikaler Position mit einem Standard-Laborständer und -halter. Alternativ können Sie handelsübliche Chromatographie-Säulenständer verwenden.
- Vor dem Anschluss an die SEC-Säule hydratisieren Sie das Probenreservoir, indem Sie 5 mL PBS durch die Fritte in einen Abfallbehälter fließen lassen. Schrauben Sie die Einlasskappe der SEC-Säule ab, geben Sie 2 ml PBS in das Probenreservoir und schließen Sie das Reservoir vorsichtig an die Säule an, da das PBS durch die Fritte heraustropft (gilt nicht für kleine SEC-Säulen). ANMERKUNG: Dieser vorherige Schritt verhindert, dass Luftblasen am oberen Rand der SEC-Säule eingeschlossen werden. Wenn Luft eingeschlossen ist, entfernen Sie den Behälter, klopfen Sie auf die Säule, um die Luftblase herauszuholen, und wiederholen Sie den Verbindungsvorgang. Für die kleinere Säule öffnen Sie einfach die Oberseite der SEC-Säule und befestigen den Probenbehälter.
- Geben Sie 47 mL (10 mL) PBS in das Probenreservoir und öffnen Sie den Boden der SEC-Säule. Lassen Sie den gesamten geladenen Probenpuffer zur Äquilibrierung durch die Säule fließen. Verwerfen Sie den Durchfluss.
- Laden Sie maximal 2 mL (0,5 mL) Probe in das Probenreservoir, verwerfen Sie den Durchfluss und lassen Sie die Probe vollständig in die Säule gelangen.
- Geben Sie sofort PBS in das Probenreservoir oder den Trichter mit einem Volumen von 14,25 mL abzüglich des Probenvolumens (3 mL abzüglich des Probenvolumens für die kleine Säule). Lassen Sie die Lösung durch die Säule fließen und verwerfen Sie diese Menge, die dem Hohlraumvolumen der Säule entspricht.
ANMERKUNG: Bei einer typischen 2-ml-Probe beträgt die Menge an PBS, die in das Probenreservoir oder den Trichter gegeben werden soll, 12,25 ml. - Positionieren Sie ein 2-ml-Mikroröhrchen mit geringer Bindung direkt unter der SEC-Säule. Geben Sie sofort 2 mL (0,5 mL) PBS in das Probenreservoir und lassen Sie es in die Säule gelangen. Beschriften Sie die ersten 2 mL (0,5 mL) des Durchflusses als Fraktion 1. Geben Sie weiterhin jeweils 2 ml (0,5 ml) in das Probenreservoir, um jede nachfolgende Fraktion zu sammeln.
ANMERKUNG: Die meisten bakteriellen EVs eluieren in den ersten 5 Fraktionen. Bei der Optimierung wurden die ersten 12 Fraktionen gesammelt. - Lagern Sie die Fraktionen bei 4 °C für die kurzfristige Lagerung (Tage) oder -80 °C für die langfristige Lagerung.