Phototaxis-Assay von filamentösen Cyanobakterien mittels fokussierter Lichtbeleuchtung

Zusammenfassung

Quelle: Weber, N. et. al., Natürliche Transformation, Proteinexpression und Kryokonservierung des filamentösen Cyanobakteriums Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt einen fokussierten LED-basierten Assay zur Untersuchung von Phototaxis in filamentösen Cyanobakterien. Die Bakterien wandern in Richtung der Lichtquelle und bilden eine dichte Anhäufung im beleuchteten Zentrum, die durch eine Pixelintensitätsanalyse des aufgenommenen Bildes visualisiert und quantifiziert wird.

Protokoll

1. Assay für Phototaxis
   1. Für Phototaxi-Experimente bereiten Sie Leuchtdiodenhalter (LED) vor (hier mit einem 3D-Drucker), in denen die ausgewählten 5 mm LEDs montiert sind, um eine Fläche von 20 mm² von unten nach oben zu bestrahlen (Abbildung 1). Verwenden Sie bei Bedarf viele LED-Halter parallel und verbinden Sie jede LED elektrisch über einen Widerstand und ein Potentiometer mit einer einstellbaren Stromversorgung. Messen und passen Sie die LED-Intensitäten je nach Experiment an. Stellen Sie sicher, dass sich die gesamte Umgebung in einem dunklen Raum oder einem geschlossenen, dunklen Behälter befindet.
   2. 8 ml des Mediums, das Phormidium-Lacuna enthält, in eine 6 cm große Petrischale geben. Stellen Sie die Lichtintensität der LED ein. Verschließen Sie die Petrischale mit dem Deckel und setzen Sie sie so auf eine LED-Halterung, dass sich die LED in der Mitte der Petrischale befindet.
   3. Nehmen Sie nach der gewünschten Dauer (in der Regel 2 Tage) ein Bild der Petrischale mit einer Smartphone-Kamera auf, die direkt auf die Position der Lichtbehandlung gerichtet ist. Verwenden Sie ein weißes LED-Panel für die Bestrahlung der Probe. Verwenden Sie die manuellen Einstellungen der Kamera. Vermeiden Sie Lichtreflexionen; Stellen Sie immer ein, dass der gleiche Abstand zwischen dem Kameraobjektiv und der Probe erreicht wird. Stellen Sie sicher, dass die Belichtungseinstellungen ein Bild ergeben, das für spätere Analysen mit ImageJ geeignet ist.
   4. Quantifizieren Sie den Durchmesser des zentralen Kreises der Filamente mit der ImageJ-Software.
      1. Öffnen Sie ImageJ, klicken Sie auf Datei | Öffnen Sie das Öffnen, wählen Sie die gewünschte Datei aus und klicken Sie auf die Eingabetaste.
      2. Wählen Sie die Schaltfläche Gerade (mit einer geraden Linie) aus. Drücken Sie die linke Maustaste, um eine Linie von einem Ende der Petrischale zum gegenüberliegenden Ende zu ziehen. Stellen Sie sicher, dass die Linie durch die Mitte des Filamentkreises verläuft.
      3. Drücken Sie Strg-K auf der Tastatur oder klicken Sie auf Analysieren | Profil plotten im Menü ImageJ. Suchen Sie nach einem x-y-Fenster mit Pixelintensitäten, die über die Entfernung aufgetragen werden - ein 1D-Profil der Petrischale. Stellen Sie sicher, dass die niedrigste Pixelintensität leicht über 0 und der höchste Wert unter 255 liegt.
      4. Schätzen Sie einen Durchschnittswert für die Pixelintensität außerhalb des Kreises und einen anderen Durchschnittswert für die Pixelintensität im Kreis. Schätzen Sie an der y-Position zwischen diesen Werten die x-Werte beider Seiten des Kreises, indem Sie mit der Maus auf diese Positionen zeigen. Notieren Sie sich beide Werte und berechnen Sie die Differenz.
      5. Den höchsten x-Wert erhalten Sie, indem Sie mit der Maus auf die y-Achse auf der rechten Seite zeigen. Beachten Sie, dass dieser Wert e den Durchmesser der Petrischale darstellt. Wenn dieser Durchmesser 5 cm beträgt, berechnen Sie den Durchmesser des zentralen Filamentkreises als d/e × 5 cm.

Ergebnisse

Abbildung 1: Phototaxie-Experiment. Links: LED-Halterung mit 4 roten LEDs, angeschlossen an ein einstellbares Netzteil. Auf jeder LED befindet sich eine 6 cm große Petrischale mit 8 mL einer Phormidium-Lacuna-Kultur. Rechts: Petrischale mit P. lacuna nach...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Petrischalen aus Polystyrol, 60 mm x 15 mm	Merck	P5481-500EA
Photometer Nanodrop ND-1000	Peqlab Biotechnologie
Photometer Uvikon XS	Goebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 10-100 μL	Gilson	Artikelnummer: FA10004M
Software, URL
BildJ		Software zur Bildbearbeitung (Pixelintensitäten, Kreisdurchmesser)
Nährmedien
f/2 -flüssiges Medium	künstliches Meerwasser, 0,1 %ige (v/v) Spurenelementlösung, 0,05 %ige (v/v) Vitaminlösung, 0,88 mM Natriumnitrat, 36 μM Mononatriumphosphat