Bewertung der Pneumokokken-Adhäsion an primäre humane Endothelzellen unter konstantem Medienfluss

Zusammenfassung

Quelle: Jagau, H. et al. Pneumokokken-Infektion von primären menschlichen Endothelzellen in ständigem Fluss. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video demonstriert die Echtzeit-Visualisierung der Pneumokokken-Bindung an Strings des Von-Willebrand-Faktors (VWF) auf Endothelzellen unter konstanten Medienströmungsbedingungen. Es beschreibt die Schritte zur Stimulierung der VWF-Freisetzung, zur Markierung der Fäden und zur Quantifizierung der bakteriellen Bindung.

Protokoll

1. Induktion der Von-Willebrand-Faktor (VWF)-Freigabe und Visualisierung von multimerisierten VWF-Strings

1. Behalten Sie die Strömungseinstellung bei, da eine Schubspannung von 10 dyn/cm² erforderlich ist, um die Multimerisierung von VWF auf lange Stränge von bis zu 200 MDa auszulösen. Induzieren Sie die Freisetzung von VWF aus endothelialem WPB durch Injektion von 136 μl einer 100 mM Histamin-Stammlösung in das Endothelzellwachstumsmedium mit ECGMS-Supplement-Mix-Medium, das im Perfusionsschlauch unter Verwendung einer Injektionsöffnung zirkuliert. Die endgültige Konzentration von Histamin im Fließmedium beträgt 1 mM. Wenn kein Injektionsanschluss verfügbar ist, kann das Histamin alternativ durch Pipettieren in das Medium der Pumpenreservoirs hinzugefügt werden.
2. Für die Immunfluoreszenzdetektion von multimerisierten VWF-Strings stoppen Sie den Durchfluss, wenn ein ausgeglichener mittlerer Füllstand in den Reservoiren erreicht ist, und injizieren Sie 20 μg eines VWF-spezifischen Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugierten Antikörpers in einem Volumen von 200 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) in das zirkulierende 13,6 mL EKGMS-Medium unter Verwendung eines Injektionsanschlusses. Wenn kein Injektionsanschluss verfügbar ist, kann der Antikörper alternativ durch Pipettieren in das Medium der Pumpenreservoire zugegeben werden. Daraus ergibt sich eine endgültige Antikörperkonzentration von 1,3 μg/ml.
3. Für die mikroskopische Abtastung mehrerer Gesichtsfelder in kurzer Zeit verwenden Sie die Fluoreszenzeinheit des Mikroskops mit einem Xenon-Fluoreszenzgerät mit 30 % Leistung und einer Epifluoreszenzkamera. Überwachen Sie die Form und Morphologie der Schicht der humanen Nabelvenen-Endothelzelle (HUVEC) mit dem Hellfeldmodus, um repräsentative Zellen auszuwählen, die für die Visualisierung der VWF-Strings geeignet sind.
4. Für die Visualisierung von grün fluoreszierenden VWF-Strings wählen Sie ein 63x/1,40 Ölobjektiv und einen 470 nm Detektionsfilter im Menü der Fluoreszenzeinheit der Mikroskopsoftware (LasX) aus. Erstellen Sie Snapshots von Z-Stapeln mit mindestens 50 repräsentativen Feldansichten, die jeweils etwa 10 morphologisch intakte HUVEC enthalten. Zur Quantifizierung der grün fluoreszierenden VWF-Strings zu verschiedenen Zeitpunkten scannen Sie mehrere Sichtfelder.

2. Mikroskopische Auswertung der bakteriellen Anheftung an VWF-Strings in der Strömung in Echtzeit

1. Quantifizierung der Pneumokokken-Bindung an die auf HUVEC-Zelloberflächen erzeugten VWF-Strings mittels Immunfluoreszenzdetektion.
   1. Halten Sie den Durchfluss aufrecht und injizieren Sie 1,35 x 10⁸ KBE/ml-exprimierende Pneumokokken mit rotem Fluoreszenzprotein (RFP) in einem maximalen Volumen von 1 ml über den Injektionsanschluss in das EKGMS-Medium. Alternativ pipettieren Sie die Bakterien in das Medium im Pumpenbehälter. Starten Sie die Scherspannung bei 10 dyn/cm² neu, um die Bakterien im Pumpensystem zirkulieren zu lassen.
   2. Wählen Sie ein 63-fach Öl-Immersionsobjektiv für die Mikroskopvergrößerung und passen Sie die Fluoreszenzfiltereinstellungen in der Mikroskopsoftware auf den RFP-Kanal (540 nm Detektionsfilter) für die Detektion von RFP-exprimierenden Pneumokokken an.
   3. Um die bakterielle Bindung an die VWF-Strings zu quantifizieren, stoppen Sie den Fluss und erstellen Sie Schnappschüsse von Z-Stapeln von mindestens 30 repräsentativen Feldansichten, die jeweils etwa 10 morphologisch intakte HUVEC enthalten, und zählen Sie die Anzahl der Pneumokokken.
   4. Verwenden Sie den einfaktoriellen ANOVA-Statistikalgorithmus, um die Daten auszuwerten, gefolgt von einem Post-hoc-Test mit zweiseitigen ungepaarten Stichproben für einen detaillierten statistischen Vergleich. P-Werte von <0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Materialien