Fluoreszenzbildgebung von Biomaterial-assoziierten bakteriellen Infektionen in Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Quelle: Zhang, X., et al. Ein Zebrafisch-Embryomodell für die In-vivo-Visualisierung und Intravitalanalyse von Biomaterial-assoziierten Staphylococcus aureus-Infektionen . J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Fluoreszenzbildgebung von Zebrafischembryonen, die mit Staphylococcus aureus injiziert wurden, was eine Quantifizierung des Infektionsverlaufs und der bakteriellen Verteilung ermöglicht, um den Einfluss von Biomaterial-Mikrosphären auf Wirt-Pathogen-Interaktionen in vivo zu bewerten.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Fluoreszenzmikroskopie des Infektionsverlaufs und der provozierten Zellinfiltration in Zebrafischembryonen

1. Betäuben Sie die Embryonen, indem Sie sie in eine 100-mm-Petrischale legen, die 0,02% (w/v) 3-Aminobenzoesäure (Tricain) enthält, um sie zu betäuben. Nach 5 Minuten übertragen Sie die Embryonen auf die Agaroseplatte, die mit E3-Medium überzogen ist, das 0,02 % (w/v) Tricain enthält, und richten Sie sie für die Injektion in einer Ausrichtung aus. Pipettieren Sie 500 μl einer PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)-2 % (wt) Methylcelluloselösung in eine Petrischale, die E3-Medium mit 0,02 % (w/v) Tricain enthält. Legen Sie die Embryonen in die Methylcelluloselösung und halten Sie sie gerade und waagerecht.
   ANMERKUNG: Methylcelluloselösung wird als "Klebstoff" verwendet, der aufgrund seiner Viskosität Embryonen vorübergehend in bester Ausrichtung für die Bildgebung immobilisieren kann.
2. Verwenden Sie ein Stereofluoreszenzmikroskop, das mit Hellfeld-, mCherry-, grün fluoreszierenden Protein- (GFP) und UV-Filtern (Ultraviolett) ausgestattet ist, um einzelne Embryonen unter identischen optimierten Einstellungen (z. B. Intensität, Verstärkung und Belichtungszeit) bei 160-facher Vergrößerung abzubilden. Stellen Sie die Fokusebene mit dem Hellfeldfilter so ein, dass die durch die Injektion verursachte Gewebeschädigung scharf ist. Stellen Sie die Z-Stapeltiefe auf 10 μm und die Schrittweite auf 5 μm ein, was die Aufnahme von 3 aufeinanderfolgenden Bildern ermöglicht.
3. Bilden Sie einzelne Embryonen einmal täglich von 5 Stunden nach der Injektion bis 2 Tage nach der Injektion. Ausschluss toter Embryonen (kein Herzschlag oder teilweise abgebauter Embryo) für die weitere Bildgebung und Analyse. Bewahren Sie die Embryonen einzeln im E3-Medium in 48-Well-Platten auf. Frischen Sie das Medium täglich auf.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polystyrol-Mikrosphären mit einem Durchmesser von 10 μm (blau fluoreszierend)	Lebenstechnik/ThemoFisher	Nr. F8829
3-Aminobenzoesäure (Tricain)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Stereo-Fluoreszenzmikroskop LM80	Leica	MDG3610450126
Methylcellulose 4000cp	Sigma-Aldrich	MO512-250G
Petrischale	Falke	353003
Petrischale	Biomerieux	NL-132
BildJ	Nicht zutreffend	Nicht zutreffend	Verknüpfung: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0	Prisma	Nicht zutreffend