In vivo Analyse implantatassoziierter bakterieller Infektionen anhand von Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Quelle: Zhang, X. et. al., Ein Zebrafisch-Embryomodell für die In-vivo-Visualisierung und Intravitalanalyse von Biomaterial-assoziierten Staphylococcus aureus-Infektionen . J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt ein Modell eines Zebrafischembryos zur Untersuchung von Infektionen, die mit implantiertem Biomaterial in Verbindung stehen. Die Injektion von Staphylococcus aureus mit Polystyrol-Mikrosphären verbessert das Überleben der Bakterien und bestätigt die infektionsfördernde Rolle der implantierten Materialien.

Protokoll

1. Herstellung von Suspensionen nur für Bakterien und Bakterien-Mikrosphären

ANMERKUNG: Es wird der Stamm Staphylococcus aureus RN4220 verwendet, der das fluoreszierende Protein mCherry (S. aureus-mCherry) exprimiert. Der Stamm S. aureus RN4220 ist im Virulenzregulator-Gen agrA (akzessorischer Genregulator A) mutiert und kann daher im Zebrafisch-Embryomodell eine relativ geringe Virulenz aufweisen. Andere S. aureus-Stämme oder andere Bakterienarten können für die Biomaterial-assoziierte Infektion (BAI) verwendet werden.

1. Entnehmen Sie 4 bis 5 Kolonien von S. aureus RN4220-Bakterien aus tryptischen Soja-Agar-Kulturplatten, die mit 10 μg/ml Chloramphenicol ergänzt sind, und kultivieren Sie die Bakterien in 10 ml tryptischer Sojabrühe, ergänzt mit 10 μg/ml Chloramphenicol, bei 37 °C unter Schütteln in die mittlere logarithmische Wachstumsphase.
   1. Während der Kultur werden 100 μl der bakteriellen Suspension in 900 μl steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Küvette (Breite von 1 cm) für eine Messung der optischen Dichte (OD) bei 620 nm (OD₆₂₀) verdünnt. Kultivieren Sie die Bakterien, bis der OD₆₂₀ 0,4–0,8 erreicht.
      ANMERKUNG: Ein OD₆₂₀ von 0,1 entspricht im Allgemeinen 3,0 x 10⁷ koloniebildender Einheit (KBE)/ml S. aureus. Der OD₆₂₀ eines Inokulums von Bakterien in der mittleren logarithmischen Wachstumsphase liegt zwischen 0,4-0,8. Für andere Bakterienarten und -stämme können andere Zeiträume für die Kultivierung erforderlich sein.
2. Zentrifugieren Sie die Bakterien bei 3.500 x g für 10 min und resuspendieren Sie die pelletierten Bakterien in 1 mL sterilem PBS. Waschen Sie anschließend die Bakterien 2 Mal mit sterilem PBS und suspendieren Sie die Bakterien schließlich in 1,1 ml 4%iger (w/v) Polyvinylpyrrolidon40 (PVP40)-Lösung in PBS.
3. Wirbeln Sie diese Bakteriensuspension vor und verdünnen Sie 100 μl der Suspension in 900 μl sterilem PBS in einer Küvette für die OD_620-Messung . Die Konzentration der Bakteriensuspension mit PVP40-Lösung anpassen. Dies ist die "Nur-Bakterien"-Suspension.
4. Biomaterialien können frei gewählt werden, um sich mit der Bakteriensuspension zu mischen. In der vorliegenden Studie werden kommerzielle Mikrosphären aus Polystyrol (PS) (blau fluoreszierend, 10 μm) verwendet. Um eine Bakterien-Mikrosphären-Suspension zu erzeugen, zentrifugieren Sie die Mikrosphären 1 min lang bei 1.000 x g Raumtemperatur, verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Mikrosphären in der Suspension "Nur Bakterien" (in PVP40-Lösung) erneut.
5. Um ungefähr gleiche Dosen von Bakterien in Gegenwart und Abwesenheit von Mikrosphären zu injizieren, muss die Konzentration der Bakterien-Mikrosphären-Suspension zwei Drittel der Konzentration der "Nur-Bakterien"-Suspension (ohne Mikrosphären) betragen. Dies wird durch Verdünnung der Bacteria-Microspheres-Suspension mit 0,5 Volumenvolut PVP40-Lösung erreicht. Mischen Sie die Suspensionen durch Vortexen. Bemerkenswert ist, dass dieses Verhältnis (zwei Drittel) für S. aureus bewertet wurde. Es ist auch für S. epidermidis geeignet, aber es wird empfohlen zu prüfen, ob dieses Verhältnis auch für andere Bakterienarten und andere Größen (als 10 μm) oder Formen von Biomaterialien (als Mikrosphären) gilt, die injiziert werden sollen.
6. Überprüfen Sie die Konzentration der "Nur-Bakterien"- und der Bakterien-Mikrosphären-Suspension durch quantitative Kultur von 10-fachen seriellen Verdünnungen wie folgt: Übertragen Sie 100 μl der Suspensionen auf eine 96-Well-Platte und verdünnen Sie sie seriell, indem Sie 10 μl Aliquots der Suspension in 90 μl steriles PBS überführen. Duplizieren Sie 10 μl Aliquots der unverdünnten und verdünnten Suspensionen auf Agaroseplatten, inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C, zählen Sie die Kolonien und berechnen Sie die Anzahl der Bakterien (koloniebildende Einheiten, KBE).

2. Zucht, Ernte und Pflege von Zebrafischembryonen

1. Befolgen Sie die allgemeinen Verfahren für die Zucht, Ernte und Pflege von Zebrafischembryonen mit den unten beschriebenen Änderungen. Kreuzen Sie eine Familie von Wildtyp-Tupfel-Langflossen-Zebrafischen (TL) oder Zebrafischen der ausgewählten transgenen Linie (hier Mpeg1: Kaede) in einem Aquarium mit einem Netz, das die erwachsenen Weibchen dazu bringt, nach dem Einschalten des Lichts Eier zu produzieren, und trennen Sie dann die erwachsenen Weibchen von den produzierten Eiern.
2. Entnehmen Sie am nächsten Tag die Embryonen und entsorgen Sie die undurchsichtigen, die nicht lebensfähig sind. Bewahren Sie etwa 60 Embryonen pro Petrischale (100 mm Durchmesser) in E3-Medium auf und inkubieren Sie es bei 28 °C. Entfernen Sie tote und abnormale Embryonen und erneuern Sie das E3-Medium täglich.

3. Vorbereitung der Injektionsnadeln

1. Bereiten Sie die Mikrokapillarnadeln aus Glas mit einem Mikropipettenabzieher für die Injektion vor. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Hitze: 772, Zug: 100, Vel: 200, Zeit: 40, Gas: 75.
2. Brechen Sie die Nadelspitze mit einer Pinzette an der Stelle, an der die Nadel einen Außendurchmesser von ca. 20 μm (für 10 μm Mikrosphären) hat, mit einem Lichtmikroskop mit einem Maßstabstab im Okular. Vermeiden Sie Nadeln mit einer sehr großen Öffnungsgröße, da sie das Überleben der Embryonen gefährden.
   ANMERKUNG: Die Öffnung kann je nach Größe und Form der zu injizierenden Biomaterialien kleiner oder größer gewählt werden. In der Literatur wurde berichtet, dass Injektionen mit Nadeln mit einer Öffnung von etwa 50 μm zu einer signifikanten Verringerung des Überlebens des Embryos führen.

4. Injektion von Suspension nur aus Bakterien oder Bakterien-Mikrosphären in Zebrafischembryonen

1. Agaroselösung (1–1,5 Gew.-% in Demi-Wasser) in der Mikrowelle erhitzen und in eine 100-mm-Petrischale geben. Legen Sie eine Kunststoffformschablone auf die Agaroselösung in der Petrischale, um Vertiefungen in der Agarose zu erzeugen, um die Embryonen in die richtigen Positionen zu bringen und die Injektion zu erleichtern. Bei Raumtemperatur inkubieren und den Schimmel entfernen, wenn die Agaroselösung erstarrt ist.
2. 3 Tage nach der Befruchtung legen Sie die Embryonen in eine 100 mm große Petrischale, die 0,02 % (w/v) 3-Aminobenzoesäure (Tricain) enthält, um sie zu betäuben. Nach 5 Minuten übertragen Sie die Embryonen auf die Agaroseplatte, die mit E3-Medium überzogen ist, das 0,02 % (w/v) Tricain enthält, und richten Sie sie für die Injektion in einer Ausrichtung aus. Für die Mpeg1: Die transgene Linie Kaede anästhesiert die Embryonen zunächst in E3-Medium, das 0,02 % (w/v) Tricain enthält. Wählen Sie dann mit einem Stereofluoreszenzmikroskop Embryonen aus, die grün fluoreszierende Proteine exprimieren.
3. Laden Sie die Nadel mit ca. 10 μl der "Nur-Bakterien"- oder Bakterien-Mikrosphären-Suspension mit einer Mikrolader-Pipettenspitze. Montieren Sie die Nadel auf einen Mikromanipulator, der mit dem Mikroinjektor verbunden ist. Für den hier verwendeten Injektor (siehe Materialtabelle) sind für Injektionen von 2–3 nL folgende Einstellungen vorzunehmen: Druck: 300–350, Gegendruck: 0, Zeit: 2 ms. HINWEIS: Die Einstellungen für den Mikroinjektor hängen vom verwendeten Injektor ab. Die Einstellungen des Injektors müssen möglicherweise für Injektionen von Bakterien angepasst werden, die mit Biomaterialien anderer Formen oder Größen gemischt sind.
   1. Verwenden Sie Nadeln mit der gleichen Öffnung für die Injektion der "Nur-Bakterien"-Suspension und der Bakterien-Mikrosphären-Suspension. Wenn die Nadel gebrochen oder verstopft ist, wechseln Sie immer gegen eine neue Nadel für weitere Injektionen.
4. Führen Sie die Nadel unter einem Lichtmikroskop (Abbildung 1) in einem Winkel von 45–60° zwischen der Nadel und dem Körper der Embryonen in das Muskelgewebe von Embryonen ein. Passen Sie die Position der Nadel im Gewebe an, indem Sie sie vorsichtig hin und her bewegen. Injizieren Sie die Embryonen mit einem Fußpedal, das mit dem Mikroinjektor verbunden ist.
5. Nach der Injektion von fluoreszierenden Bakterien bewerten Sie die Embryonen für eine erfolgreiche Infektion unter einem Stereofluoreszenzmikroskop. Verwerfen Sie die Embryonen, die negativ bewertet wurden (keine sichtbaren fluoreszierenden Bakterien oder keine sichtbaren fluoreszierenden Mikrosphären). Bewahren Sie die Embryonen einzeln im E3-Medium in 48-Well-Platten auf. Frischen Sie das Medium täglich auf.

5. Zerkleinerung von Embryonen, mikroskopische Bewertung und quantitative Kultivierung von Bakterien

1. Bewerten Sie alle Embryonen mikroskopisch auf das Vorhandensein fluoreszierender Bakterien mit einem Stereofluoreszenzmikroskop, beginnend unmittelbar nach den Injektionen und an jedem folgenden Tag, bis die Embryonen nach dem Zufallsprinzip für die quantitative Kultur ausgewählt wurden.
2. Wählen Sie kurz nach der Injektion nach dem Zufallsprinzip einige lebende infizierte Embryonen (5 bis 6 in der vorliegenden Studie) aus und übertragen Sie sie einzeln mit sterilen Spitzen in getrennte 2-ml-Mikroröhrchen. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Embryonen einmal vorsichtig mit sterilem PBS und fügen Sie 100 μl steriles PBS hinzu.
3. Geben Sie 2–3 sterile Zirkonoxidkügelchen (2 mm Durchmesser) in jedes Fläschchen und zerkleinern Sie die Embryonen mit dem Homogenisator (siehe Materialtabelle) bei 3.500 U/min für 30 s. Kultivieren Sie das Homogenat quantitativ, wie in Schritt 1.3 beschrieben.
   ANMERKUNG: Andere Homogenisatoren erfordern möglicherweise andere Einstellungen.
4. An den folgenden Tagen nach der Injektion werden mehrere Embryonen nach dem Zufallsprinzip für die quantitative Kultur gemäß Schritt 5.3 ausgewählt.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematisches Verfahren der Co-Injektion von Bakterien-Mikrosphären-Suspension in den Schwanzmuskel von Zebrafischembryonen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tryptischer Soja-Agar	BD Difco	236950	Einheit für Medienvorbereitung bei AMC
Tryptische Sojabrühe	BD Difco	211825
Polyvinylpyrrolidon40	Applichem	Nr. A2259.0250
Polystyrol-Mikrosphären mit einem Durchmesser von 10 μm (blau fluoreszierend)	Lebenstechnik/ThemoFisher	Nr. F8829
Mikrokapilärglas (1 mm AD x 0,78 mm ID)	Harvard-Apparatur	30-0038
Instrument zum Abziehen von Mikropipetten	Sutter Instrument Inc	Flammen p-97
Lichtmikroskop LM 20	Leica	MDG33 10450123
3-Aminobenzoesäure (Tricain)	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Parlamentsabgeordneter von Agarose	Roche	11388991001
Stereo-Fluoreszenzmikroskop LM80	Leica	MDG3610450126
Microloader-Pipettenspitzen	Eppendorf	5242956.003
Mikromanipulator M3301 mit M10-Stativ	Welt Präzisionsinstrumente	00-42-101-0000
FemtoJet express Mikroinjektor	Eppendorf	Artikel-Nr.: 5248ZO100329
Microtrube 2ml pp	Sarstedt	72.693.005
Zirkonia-Kügelchen	Bio-Verbindung	Artikel-Nr.: 11079124ZX
MagNA Lyser	Roche	41416401
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	Nr. C0378
Gyrotory-Schüttler (für Bakterienwachstum)	New Brunswick Scientific	G10
Inkubator für Zebrafische	VWR	Inzidenz
Küvetten	MARKE	759015
Zentrifuge	Hettich-Zentrifugen	ROTANTA 460R
Spektrometer	Pharmazie Biotech	Ultrospec®2000
Zange	Sigma-Aldrich	F6521-1EA
48 Well-Platten	Greiner bio-one	677180
96 Well-Platten	Greiner bio-one	655161
Petrischale	Falke	353003
Petrischale	Biomerieux	NL-132