Herstellung eines einzelligen bakteriellen Inokulums

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Niu, L., et al., Visualisierung des lytischen Zelltods von Makrophagen während einer mykobakteriellen Infektion in Zebrafischembryonen über Intravitalmikroskopie. J. Vis. Exp. (2019)

Dieses Video zeigt die Herstellung einer Mycobacterium marinum-Einzelzellsuspension aus einer Kultur in der Spätlog-Phase für den konsistenten Einsatz in Infektionsassays und Downstream-Anwendungen.

Protokoll

1. Mycobacterium marinum Einzelzell-Inokulum-Zubereitung (Abbildung 1)

Tauen Sie den Cerulean-fluoreszierenden Mycobacterium marinum-Glycerinbestand bei -80 °C auf und inokulieren Sie eine 7H10-Agarplatte mit 10 % (v/v) OADC (Ölsäure, Albumin, Dextrose, Katalase), 0,25 % Glycerin und 50 μg/ml Hygromycin. Inkubieren Sie die Platte bei 32 °C für ca. 10 Tage.
Wählen Sie eine Kolonie mit positiver Fluoreszenz aus und inokulieren Sie 3 ml 7H9-Medium mit 10 % OADC, 0,5 % Glycerin und 50 μg/ml Hygromycin.
1. Inkubieren Sie die Inokulation bei 32 °C und 100 Umdrehungen pro Minute (U/min) für 4–6 Tage, bis die Kultur die logarithmische Phase erreicht (OD₆₀₀ = 0,6–1,0).
2. Subkultur (1:100) in 30 ml frischem 7H9-Medium mit 10 % OADC, 0,5 % Glycerin, 0,05 % Tween-80 und 50 μg/ml, bis der OD₆₀₀ ~1,0 erreicht.
  ANMERKUNG: An dieser Stelle empfiehlt sich ein Subkultur-Schritt für die höchste Kulturqualität. Unserer Erfahrung nach führt die direkte Zugabe des Klons zu einem großen Volumen Medium zur Bildung von Bakterienklumpen.
Sammeln Sie M . marinum-Zellen wie unten beschrieben.
1. Zentrifugieren Sie bei 3.000 x g für 10 min, um das M. marinum als Pellet zu sammeln. Der Überstand ist bis auf 300 μl vollständig zu verwerfen und zum Auftreiben des Pellets zu verwenden.
2. Fügen Sie 3 ml 7H9-Medium mit 10 % Glycerin hinzu, um das Pellet weiter zu resuspendieren, und beschallen Sie die Suspension dann in einem Wasserbad bei 100 W bei 15 s EIN, 15 s AUS für insgesamt 2 Minuten.
  ANMERKUNG: Durch Beschallung wird ein einzelliges Homogenat für das Inokulum erreicht, das ein Verstopfen der Mikroinjektionsnadel verhindert.
Übertragen Sie die Bakteriensuspension in eine 10-ml-Spritze und leiten Sie sie durch einen 5-μm-Filter, um Klumpen zu entfernen.
Messen Sie die optische Dichte (OD) der Suspension mit einem Spektralphotometer und verdünnen Sie sie auf OD₆₀₀ = 1,0 mit 7H9-Medien mit 10 % Glycerin. Die Suspension wird in 10 μl Aliquote aufgeteilt und für die spätere Verwendung bei -80 °C im Gefrierschrank gelagert.
Die Bakterienkonzentration des Inokulums (KBE/ml) wird durch serielle Verdünnung und Beschichtung des Bakterienbestands auf einer 7H10-Agarplatte bestätigt, die 10 % (v/v) OADC, 0,5 % Glycerin und 50 μg/ml Hygromycin enthält.

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Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Präparation von einzelligen Bakterien. Nach dem beschriebenen Verfahren wurden einzellige Cerulean-fluoreszierende Mycobacterium marinum-Bestände erzeugt.