Gewinnung von zytotoxischen Amyloiden nach bakterieller Infektion von Lungenendothelzellen der Ratte

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Balczon, R., et al. Verfahren zum Nachweis zytotoxischer Amyloide nach Infektion von Lungenendothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung eines zytotoxischen Überstands aus pulmonalen Endothelzellen nach einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa. Es wird beschrieben, wie bakterielle Effektorproteine die Struktur von Wirtszellen stören und die Freisetzung von zytotoxischen Amyloid-Oligomeren in den Überstand induzieren.

Protokoll

Erzeugung zytotoxischer Überstände:

Primärkulturen von pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen (PMVECs) der Ratte wurden aus der Cell Culture Core Facility am Center for Lung Biology der University of South Alabama gewonnen.

Für die Erzeugung von zytotoxischen Überständen werden 2 x 10⁶ Zellen in einzelne 150 cm große Schalen gefüllt und 3 - 4 Tage lang wachsen gelassen, bis eine Konfluenz erreicht ist. Verwenden Sie zwei Platten pro Experiment.
Um einen Überstand herzustellen, waschen Sie eine der beiden 150-cm-Schalen mit PMVECs mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, trypsinisieren Sie und zählen Sie dann die Zellen. Waschen Sie die andere Schale mit PMVECs mit Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) und infizieren Sie sich dann mit einem der beiden Stämme von Pseudomonas aeruginosa bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 20:1. Dies wird wie folgt erreicht:
1. Für P. aeruginosa, OD₅₄₀ 0,25 = 2 x 10⁸ KBE/ml. Um diese Verdünnung vorzubereiten, geben Sie 1 ml HBSS in eine 1 ml Einwegküvette. Kratzen Sie genügend Bakterien von der Platte, bis bei der Messung mit einem Spektralphotometer ein OD₅₄₀ von 0,25 erreicht wird. Im nächsten Schritt wird berechnet, wie viele Bakterien benötigt werden.
2. Sobald die Anzahl der PMVECs in der Kulturschale bestimmt ist, bestimmen Sie die geeignete Anzahl von Bakterien, die in die zweite, nicht trypsinisierte Kulturschale mit den PMVECs gegeben werden sollen. Wenn beispielsweise festgestellt wird, dass die Kulturschale von PMVECs 1,3 x 10⁷ Zellen enthält, dann bereiten Sie 1,3 x 10⁷ Zellen x 20 Bakterien/Zelle x 1 ml/2 x 10⁸ KBE = 1,3 ml Bakterien vor.
3. Verdünnen Sie die 1,3 ml Bakterien in HBSS auf ein Endvolumen von 20 ml, so dass die gesamte Oberfläche einer 150 cm langen Schale mit Flüssigkeit bedeckt werden kann, und geben Sie dann die verdünnten Bakterien auf die Platte mit PMVECs.
4. Die mit den Bakterien geimpften PMVECs werden bei 37 °C in einem 5 % CO₂-Inkubator für 4 - 5 h inkubiert, bis sich bei mikroskopischer Betrachtung der Platte Lücken in der Zellmonoschicht bilden (siehe Abbildung 1 für den richtigen Grad der Lückenbildung).
5. Sammeln Sie den Überstand und zentrifugieren Sie ihn dann 10 Minuten lang bei 2.000 x g in einer Tischzentrifuge, um Zelltrümmer zu entfernen.
  Anmerkung: Für diesen Schritt kann jede Tischzentrifuge verwendet werden, die in der Lage ist, eine ausreichende g-Kraft zu erzeugen, um unlysierte Zellen und große Zellfragmente zu pelletieren.
6. Gießen Sie den Überstand in eine Spritze, an dessen Ende ein 0,2-μm-Filter befestigt ist, und führen Sie den Überstand dann durch den Filter, um Bakterien zu entfernen.
7. Zur Prüfung der Zytotoxizität wird ein Aliquot des sterilen Überstands verwendet, und der Rest des Überstands wird für die künftige Verwendung bei -80 °C eingefroren.

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Ergebnisse

Abbildung 1. Auswirkungen der Inokulation von P. aeruginosa auf die PMVEC-Morphologie. Eine konfluente Monoschicht von PMVECs vor (A) und vier Stunden nach der Zugabe (B) des PA103-Stammes von P. aeruginosa. In den infizierten Zel...