Verfolgung der bakteriellen Infektionsdynamik in einer Maus mit Hilfe von Biolumineszenz

Zusammenfassung

Quelle: Valentine, M. E., et al. Generierung von In-Frame-Gendeletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Test auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video demonstriert die Verwendung von Biolumineszenz, um das in vivo-Verhalten von virulenten und abgeschwächten Bakterienstämmen bei Mäusen zu visualisieren und zu vergleichen. Es beschreibt die Herstellung von biolumineszierenden Bakteriensuspensionen und deren intraperitoneale Injektion in Mäuse. Der virulente Stamm zeigt eine systemische Spreizung, während der abgeschwächte Stamm lokalisiert bleibt und allmählich abgebaut wird, was durch das Fading-Signal angezeigt wird.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Inokulation von Tieren mit Bakterienstämmen durch Injektion
   1. Am Morgen der Injektion werden die Kryoröhrchen der getesteten Bakterienstämme entnommen und 3-4 Stunden lang bei 4 °C aufgetaut. Tauen Sie für jede Maus, die injiziert wird, 0,5 ml auf. Bewahren Sie die Durchstechflaschen nach dem Auftauen auf Eis auf und injizieren Sie Mäuse innerhalb von 2 Stunden.
   2. Nach dem Auftauen jedes Kryoröhrchen in ein neues 2-ml-Röhrchen umfüllen und 10 Minuten lang bei 4.500 x g zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 1 ml 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) resuspendieren.
   3. Nochmals bei 4.500 x g für 10 min zentrifugieren. Überstand verwerfen und Pellet in 1x PBS auf eine Endkonzentration von 2,5 x 10⁹ KBE/ml (KBE: koloniebildende Einheiten) resuspendieren. Die genaue Menge an 1x PBS variiert leicht zwischen den Stämmen.
      1. Entnehmen Sie 3 Proben aus der endgültigen Suspension jedes Stammes, um KBE/ml, Genotyp und Phänotyp wie oben beschrieben zu validieren.
   4. Für jeden Stamm aliquotieren Sie 1,5 ml PBS/Zellsuspension in ein 2-ml-Röhrchen pro 5 Mäuse, um die Anzahl der Eintritte in das Röhrchen zu begrenzen. Bereiten Sie außerdem Röhrchen mit 1x PBS für Kontrollinjektionen vor.
   5. Sammeln Sie Mäuse (10 männliche und 10 weibliche C57BL/6 pro Gruppe für dieses Experiment) und Materialien, die für Injektionen benötigt werden (Spritzen, Nadeln, Behälter für scharfe Gegenstände, Marker, Stift und Papier usw.). Begeben Sie sich in den sterilen Tieroperationssaal. Wischen Sie alle Oberflächen mit Desinfektionstüchern ab.
      1. Um Stress und Verletzungsrisiko für den Experimentator zu vermeiden, bringen Sie jeweils nur ein Geschlecht und eine Versuchsgruppe von Mäusen in den Operationssaal (z. B. eine Gruppe von 10 männlichen Mäusen, die mit einem bestimmten Stamm infiziert werden sollen). Tragen Sie zwei Paar Latexhandschuhe, um ein Durchstechen der Handschuhe zu vermeiden, wenn sie gebissen werden. Tragen Sie einen Laborkittel, eine Schutzbrille und eine Gesichtsmaske, um eine Kontamination zu vermeiden.
   6. Beginnen Sie die Injektionen der Kontrollgruppe mit 1x PBS. Dadurch wird festgestellt, ob Nebenwirkungen allein durch die Injektion verursacht werden.
      1. Nimm eine Maus aus dem Käfig. Entfernen Sie jeweils nur eine Maus.
      2. Wiegen Sie die Maus und markieren Sie ihren Schwanz mit einem Permanentmarker, um den Gewichtsverlust nach der Injektion zu verfolgen.
      3. Öffnen Sie eine neue 1-ml-Spritze und eine 27-g-Nadel (verwenden Sie für jede Maus eine neue Spritze und Nadel, um eine Kontamination auszuschließen) und injizieren Sie 200 μl steriles 1x PBS.
         1. Fassen Sie die Maus mit Daumen und Zeigefinger hinter die Ohren. Kneifen, um eine Hautfalte im Nacken zu bilden, an der Sie sich festhalten können - eine engere Falte reduziert die Bewegung des Halses und das Risiko, während der Injektion gebissen zu werden. Befestigen Sie den Schwanz mit dem kleinen Finger in der Handfläche, um die Maus mit wenig Bewegung flach zu halten.
         2. Drehen Sie die Maus um und führen Sie die Nadel im 30°-Winkel in die Bauchhöhle links oder rechts der Mittellinie ein. Heben Sie die Nadel nach dem Einstechen leicht an, um sicherzustellen, dass sie in den intraperitonealen Bereich und nicht in Organe eingeführt wurde. Injizieren Sie das PBS langsam und ziehen Sie dann die Nadel zurück.
         3. Legen Sie die gebrauchte Nadel in einen dafür vorgesehenen Behälter für biologisch gefährliche scharfe Gegenstände. Verwenden Sie die Spritze oder Nadel nicht wieder. Typisch ist ein Bolus an der Injektionsstelle.
      4. Bewegen Sie die Maus nach der Injektion in einen separaten Käfig.
      5. Wiederholen Sie den Vorgang mit der nächsten Maus. Nachdem alle Mäuse eines Käfigs injiziert wurden, bringen Sie sie sofort in ihren ursprünglichen Käfig zurück.
   7. Beginnen Sie nach der Injektion der Kontrollgruppe mit der Injektion von Suspensionen der zu testenden Stämme nach dem gleichen Verfahren.
      1. Injizieren Sie 200 μl der Zellsuspension. Beginnt man mit Zellsuspensionen von 2,5 x 10⁹ KBE/ml, erhält jede Maus 5 x 10⁸ KBE.
         ANMERKUNG: Diese Konzentrationen wurden mit vorläufigen Tierversuchen optimiert, um die letalen Dosen jedes Stammes zu bestimmen. Die Dosierung muss möglicherweise für andere Stämme/Spezies angepasst werden.
   8. Sobald alle Injektionen abgeschlossen sind, bringen Sie die Mäuse in den Haltungsraum zurück, um den Stress zu lindern. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit Desinfektionstüchern.
   9. Überwachen Sie die Tiere auf Mortalität nach der Injektion, indem Sie die Käfige alle 3 Stunden für 72 Stunden und alle 12 Stunden für 10 Tage auf tote Mäuse überprüfen. Notieren Sie das Gewicht von Mäusen alle 12 Stunden, um den Gewichtsverlust aufgrund von Krankheit zu bestimmen.

Materialien