Generierung von Double-Crossover-Rekombinanten von Pseudomonas aeruginosa für die gezielte Gendeletion

Zusammenfassung

Quelle: Valentine, M. E., et al. Generierung von In-Frame-Gendeletionsmutanten in Pseudomonas aeruginosa und Test auf Virulenzabschwächung in einem einfachen Mausmodell der Infektion. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt die Erzeugung von Double-Crossover-Rekombinanten in Pseudomonas aeruginosa unter Verwendung einer plasmidbasierten Gendeletionsstrategie. Der Prozess beinhaltet die Selektion von Bakterien, die ein nicht-replikatives Plasmid beherbergen, das über einen einzigen Crossover in das Genom integriert ist, und dann die Induktion eines zweiten Rekombinationsereignisses unter Saccharoseselektion, um das Plasmid herauszuschneiden. Die erfolgreiche Double-Crossover-Rekombination wird durch den Verlust der Antibiotikaresistenz und die Fähigkeit, auf saccharosehaltigen Medien zu wachsen, bestätigt.

Protokoll

1. Nachweis von Double-Crossover-Rekombinanten von P. aeruginosa

1. Für jede Bouillonkultur werden 10 μl Kultur auf eine vorgewärmte Platte PIA (Pseudomonas Isolation Agar) geimpft, die mit 10 % Saccharose (ohne Glycerin) und Streifen für isolierte Kolonien ergänzt wird. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C.
2. Nehmen Sie am nächsten Tag die Platten aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie auf Wachstum. Saccharoseresistente Kolonien sollten Double-Crossover-Rekombinanten sein (d. h. das Plasmid über ein Rekombinationsereignis zwischen der anderen homologen Region des Plasmidinserts und dem P. aeruginosa-Chromosom vom Chromosom entfernt haben).
   1. Pflastern Sie mindestens 20 Kolonien mit sterilen Zahnstochern auf vorgewärmte Platten aus: 1) PIA, 2) PIA, supplementiert mit 10% Saccharose (ohne Glycerin) und 3) PIA, supplementiert mit 300 μg/ml Carbenicillin.
3. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 °C.
4. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie auf Wachstum. Echte Double-Crossover-Rekombinanten sind Carbenicillin-empfindlich und Saccharose-resistent (d. h. Kolonien, die auf PIA und PIA mit Saccharose supplementiert wuchsen, aber nicht auf PIA, die mit Carbenicillin supplementiert wurde).

Materialien