Präparation und Isolierung von Streptomyces venezuelae Sporen aus einer Flüssigkultur

Zusammenfassung

Quelle: Schlimpert, S., et al. Fluoreszenz-Zeitraffer-Bildgebung des kompletten Lebenszyklus von S. venezuelae mit einem mikrofluidischen Gerät. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Kultivierung und Isolierung von Sporen aus Streptomyces venezuelae. Sporen, ruhende Zellen, die Bakterien helfen, Stress zu überleben, werden während der Nährstofflimitierung produziert und durch Zentrifugation gesammelt. Das Verfahren gewährleistet eine reine, kalt gelagerte Sporensuspension für nachgelagerte Anwendungen.

Protokoll

1. Isolierung frischer Streptomyces venezuelae-Sporen und Herstellung des verbrauchten Kulturmediums

1. 30 ml Maltose-Hefeextrakt-Malzextrakt (MYM) Medium, ergänzt mit 60 μl R2 Spurenelementlösung (TE), mit 10 μl Sporen des Stammes SV60 [attBφBT1::p SS209 (PdivIVA-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)] impfen. Für ein gleichmäßiges Wachstum und eine gleichmäßige Sporulation der Zellen verwenden Sie einen Kolben mit Schotter oder einen Kolben, der eine Feder enthält, um eine ausreichende Belüftung zu ermöglichen.
2. Kultivieren Sie die Zellen für 35-40 Stunden bei 30 °C und 250 U/min.
3. Untersuchen Sie die Zellen mit einer flüssigkeitsgelagerten Phasenkontrastmikroskopie. Zu diesem Zeitpunkt sind Myzelfragmente und Sporen sichtbar.
4. Zentrifugieren Sie 1 ml Zellen in einer Tischzentrifuge bei 400 x g für 1 Minute, um das Myzel und größere Zellfragmente zu pelletieren.
5. Etwa 300 μl Überstand, der eine Sporensuspension enthält, in ein neues 1,5-ml-Röhrchen umfüllen und auf Eis legen. Bewahren Sie das restliche Kulturmedium auf
6. Die Sporen 1:20 in MYM-TE verdünnen (Endkonzentration: 0,5-5 x 10⁷ Sporen/ml) und bis zur Verwendung auf Eis legen.
   HINWEIS: Obwohl die genauen Bedingungen, die die Sporulation bei Streptomyces auslösen, nicht verstanden werden, stimuliert die Verwendung von verbrauchtem MYM-TE-Medium, einschließlich aller unbekannten extrazellulären Signale aus einer sporulierenden Kultur, die Sporulation.
7. 10 ml des restlichen Kulturmediums werden filtriert, um verbrauchtes MYM-TE zu erhalten, das frei von Sporen und Myzelfragmenten ist. Verwenden Sie einen sterilen 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter und geben Sie verbrauchtes MYM-TE in ein steriles 15-ml-Röhrchen.
8. Halten Sie das vorbereitete verbrauchte MYM-TE einige Tage lang bei 4 °C, wenn zusätzliche Experimente mit ähnlichen Wachstumsbedingungen durchgeführt werden sollen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Maltose-Hefe Exctract-Malz Extrakt (MYM)4 g Maltose4 g Hefeextrakt10 g Malzextrakt 1 L H2O mit 50 % Leitungswasser und 50 % Umkehrosmosewasser zugeben und nach dem Autoklavieren mit 200 ml R2 Spurenelementlösung pro 100 ml ergänzen			Sporulationsmedium zur Kultivierung von Streptomyces venezuelae SV60
R2 Spurenelementlösung (TE)8 mg ZnCl240 mg FeCl3-6H 2O2 mg CuCl2-2H 2O2 mg MnCl2-4H 2O2 mg Na2B4O7-10H 2O2 mg (NH4)6Mo7O24-4H 2Oadd 200 ml H2OAutoclave und bei 4 ΰC lagern			Hinzufügen von 0,002 Volumes zu MYM
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)	Sigma	P4417-100TAB	Wird zum Nachfüllen von Einlaufmulden von ungenutzten Bahnen in B04A-Platten verwendet, um die Platte für die kurzfristige Lagerung vorzubereiten.
0,22 μm Spritzenvorsatzfilter	Satorius stedim	16532-K	Aufbereitung von verbrauchtem MYM-TE