Fluoreszenz-Zeitraffer-Bildgebung des Lebenszyklus von Streptomyces venezuelae

Zusammenfassung

Quelle: Schlimpert, S. et al. Fluoreszenz-Zeitraffer-Bildgebung des kompletten Lebenszyklus von S. venezuelae mit einem mikrofluidischen Gerät. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Fluoreszenz-Zeitraffer-Bildgebung des gesamten Lebenszyklus des Bakteriums Streptomyces venezuelae mit einem mikrofluidischen Gerät, um die Keimung, das Hyphenwachstum und die Sporulation in Echtzeit zu visualisieren.

Protokoll

1. Aufbau des Mikroskops und des Zeitrafferprotokolls

Anmerkung: Diese Methode wurde an einem vollmotorisierten und automatisierten inversen Weitfeldmikroskop implementiert, das mit einer sCMOS-Kamera, einer Halogen-Metalldampflampe, einem Hardware-Autofokus, einer Tischhalterung für 96-Well-Platten und einer Klimakammer ausgestattet ist.

1. Heizen Sie die Klimakammer vorher auf 30 °C vor, um Probleme mit dem Autofokus nach dem Start des Experiments zu vermeiden. Der Zeitaufwand hängt von der verwendeten Klimakammer, dem Mikroskop und dem Heizsystem ab. Beginnen Sie am Abend vor dem Experiment mit dem Aufheizen des Systems.
2. Schalten Sie das Mikroskop und die Automatisierungs- und Steuerungssoftware für die Mikroskopie ein. Verwenden Sie ein Ölimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) für eine optimale Signalerfassung und räumliche Auflösung, z. B. ein 100X, 1,46 NA Öl-DIC-Objektiv. Wählen Sie geeignete Filter und dichromatische Spiegel aus, um Bilder mit differentiellem Interferenzkontrast (DIC) und Bildern von gelb-fluoreszierenden und rot-fluoreszierenden Proteinfusionen zu erhalten.
3. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv und geben Sie Immersionsflüssigkeit auf den Boden des Bildgebungsfensters auf der mikrofluidischen Platte, um die Zellfokussierung während der Bildaufnahme zu verbessern. Montieren Sie das versiegelte mikrofluidische Gerät vorsichtig auf dem Tisch des inversen Mikroskops. Achten Sie darauf, dass die Platte fest in der Tischhalterung sitzt und sich im Laufe des Versuchs nicht verschiebt.
4. Bringen Sie das Bildgebungsfenster der mikrofluidischen Kulturkammer mit den eingebetteten Positionsmarkierungen zur Orientierung in den Fokus. Fokussieren Sie sich auf den äußersten linken Teil der ersten Strömungskammer (mit "A" gekennzeichnet) mit der Fallengröße 5, was einer Fallenhöhe von 0,7 μm entspricht.
5. In der Mikrofluidik-Software werden Wägezellen aus der Einlassvertiefung 8 bei 4 psi für 15 Sekunden gewendet. Überprüfen Sie die Zelldichte in der Kulturkammer, indem Sie den Tisch über das Bildgebungsfenster bewegen. Wenn keine Sporen gefangen wurden, wiederholen Sie den Schritt der Zellbeladung oder erhöhen Sie alternativ den Ladedruck und/oder die Zeit, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist (1-10 Sporen pro Bildgebungsfenster mit 2.048 x 2.048 Pixeln). Vermeiden Sie eine Überlastung der Kulturkammer. Anmerkung: Normalerweise verwenden wir Fallengröße 5 für die Bildgebung von Streptomyces, aber wir haben auch gute Ergebnisse mit den Fallengrößen 4 und 3 erzielt.
6. Starten Sie das Strömungsprogramm in der Steuerungssoftware und lassen Sie die mikrofluidische Platte 1 Stunde lang im Mikroskoptisch wärmeausgleichen, bevor Sie mit der Bildaufnahme beginnen.
7. Richten Sie in der Mikroskopsteuerungssoftware eine mehrdimensionale Aufnahme ein, um im Laufe der Zeit mehrere Bilder an mehreren Tischpositionen aufzunehmen:
   1. Für Automatisches Speichern: Geben Sie ein Verzeichnis für das automatische Speichern der Bilddateien an.
   2. Bestimmen Sie für die Beleuchtungseinstellungen im Voraus die optimalen Beleuchtungseinstellungen für jedes einzelne Konstrukt. Für das skizzierte Experiment werden die folgenden Belichtungszeiten verwendet: DIC 150 ms, YFP 250 ms, RFP 100 ms.
   3. Für Zeitreihen: Richten Sie eine Zeitreihe ein, um Bilder zu den gewünschten Zeitpunkten nacheinander aufzunehmen. Um den Lebenszyklus von S. venezuelae abzubilden, wählen Sie ein Zeitintervall von 40 Minuten über einen Zeitraum von 24 Stunden.
   4. Für Tischpositionen und Autofokus: Scannen Sie die Kulturkammer, indem Sie den Tisch verschieben, und speichern Sie die Tischpositionen für jede gewünschte Bildposition. Stellen Sie sicher, dass die einstufigen Positionen ausreichend voneinander entfernt sind, um Photobleiche und Phototoxizität zu minimieren. Verwenden Sie in der Regel bis zu 12 Positionen. Führen Sie die Autofokusroutine für jeden Zeitpunkt aus, um eine langsame Fokusdrift zu korrigieren. Falls in der Mikroskopsteuerungssoftware verfügbar, stellen Sie die Autofokusstrategie auf "lokale Oberflächenaktualisierung durch Hardware-Autofokus" ein. Sobald die Z-Koordinaten der ausgewählten Tischpositionen überprüft wurden, aktivieren Sie den Hardware-Autofokus.
8. Starten Sie das Zeitraffer-Experiment in der Mikroskopsteuerungssoftware.
9. Überprüfen Sie, ob alle Bühnenpositionen zu späteren Zeitpunkten noch scharf sind. Bei Zeitrafferexperimenten, die sich über mehrere Stunden erstrecken, beobachten wir gelegentlich eine Tischdrift, selbst wenn der Autofokus verwendet wird. Wenn Tischpositionen neu fokussiert werden müssen, stoppen Sie das Experiment zu einem geeigneten Zeitpunkt, passen Sie den Fokus an und starten Sie das Experiment innerhalb des definierten Bildgebungszeitintervalls neu.
10. Stoppen Sie die Bildaufnahme nach 24-30 Stunden oder wenn sich die Hyphen in der interessierenden Region zu Sporen differenziert haben. Stoppen Sie dann das Durchflussprogramm in der Software und zerlegen Sie das mikrofluidische Gerät.
11. Bereiten Sie die gebrauchte mikrofluidische Platte für die kurzfristige Lagerung vor. Entfernen Sie das restliche Medium aus Vertiefung 1 bis 6, leeren Sie die Abfallvertiefung 7 und die Zellladevertiefung 8. Unter sterilen Bedingungen werden gebrauchte Vertiefungen der Spur "A" und die Vertiefungen der ungenutzten Bahnen ("B" bis "D") auf der Platte mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) erneut befüllt. Versiegeln Sie die Platte mit Parafilm, um ein Austrocknen zu verhindern, und lagern Sie sie bei 4 °C.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
B04A CellAsic ONIX Platte für Bakterienzellen	Merck-Millipore	B04A-03-5PK	Mikrofluidische Kulturplatten
CellAsic ONIX Mikrofluidisches Perfusionssystem und ONIX FG (Version 5.0.2)	Merck-Millipore	EV-262	Die aktuelle ONIX-Ausgabe (Juli 2015) und eine Anleitung zur Nutzung des Programms finden Sie hier: http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 Mikroskop	Zeiss	431007-9902-000	Vollautomatisches und motorisiertes inverses Weitfeldmikroskop
Brutkasten XL multi S1 mit Temperaturmodul S1 und Heizgerät XL S2	Zeiss	411857-9061-000	Klimakammer, die das Mikroskop umgibt
Plan-Apochromat 100x/1,46 Öl DIC Objektiv	Zeiss	420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2	Hamamatsu Photonics K.K.	Nr. C11440-22CU
Beleuchtung HXP 120V	Zeiss	423013-9010-000
FL Filterset 46 HE YFP schaltfrei	Zeiss	489046-9901-000	Fluoreszenzfilter-Set, Anregung 500/25 nm, Emission 535/30 nm
FL Filterset 63 HE RFP schaltfrei	Zeiss	489063-0000-000	Fluoreszenzfilter-Set, Anregung 572/25 nm, Emission 629/30 nm
Montagerahmen K-M für Multiwell-Platten	Zeiss	000000-1272-644	Tischhalter für mikrofluidische Platte
ZEN pro 2012	Zeiss	410135-1002-120	Steuerungssoftware für Mikroskope
ZEN-Modul Zeitraffer	Zeiss	410136-1031-110	Softwaremodul zum Einrichten von Zeitraffermikroskopie-Experimenten
Kacheln/Positionen des ZEN-Moduls	Zeiss	410136-1025-110	Softwaremodul zum Speichern bestimmter Tischpositionen (xzy)
Fidschi	Open-Source-Softwarepaket	http://fiji.sc/Fiji	Generierung von Zeitrafferfilmen
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)	Sigma	P4417-100TAB	Wird zum Nachfüllen von Einlaufmulden von ungenutzten Bahnen in B04A-Platten verwendet, um die Platte für die kurzfristige Lagerung vorzubereiten.
SV60	John Innes Centre Stamm Sammlung		S. venezuelae-Stamm , der divIVA-mcherry und ftsZ-ypet exprimiert