Schwarmverhalten von Pseudomonas aeruginosa unter Antibiotikabelastung

Zusammenfassung

Quelle: Bru, J., et al., Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Analyse des Schwarmverhaltens von Pseudomonas aeruginosa , indem das Bakterienwachstum von einer zentralen Kultur zu Satellitenspots beobachtet wird, die dieselbe Kultur mit einem Antibiotikum mischen, unter Verwendung eines Agarplatten-Setups und Zeitraffer-Bildgebung.

Protokoll

1. Wachstum von P. aeruginosa und Beschichtungsbedingungen

1. Bereiten Sie 400 mL Lysogeny-Bouillon (LB) zu, indem Sie 10 g LB-Miller-Pulvermischung zu 400 mL ddH₂O hinzufügen. Fügen Sie weitere 8 g Agar für 2%ige LB-Agar-Petrischalen hinzu. Autoklav zum Sterilisieren.
2. Gießen Sie 20 ml geschmolzenes LB-Agar-Medium in Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur erstarren. Lagern Sie das flüssige Medium bei Raumtemperatur und die Agarplatten bei 4 °C.
3. Streifen Sie P. aeruginosa auf einer LB-Agar-Petrischale aus einer gefrorenen Brühe, die bei -80 °C mit sterilen Schlaufen oder Holzstäbchen gelagert wurde. Die Petrischale über Nacht bei 37 °C auf den Kopf stellen. LB-Agarplatte bis zu 1 Woche bei 4 °C lagern.
4. Entnehmen Sie eine einzelne Kolonie mit einer sterilen Schlaufe oder einem Holzstäbchen aus der Petrischale, inokulieren Sie sie in 2 mL LB-Medium und inkubieren Sie die Kultur über Nacht (16–18 Stunden) bei 37 °C in einer Rolltrommel bei 100 U/min.
5. Pipettieren Sie 5 μl der Übernachtkultur aus Schritt 1.4 mit einer P20-Pipette und spotten Sie in der Mitte der Schwarmagarplatte, indem Sie sich der Pipettenspitze in einem Winkel (10–45°) von 2,5 cm über dem Fleckenbereich nähern, bis zum ersten Anschlag pipettieren und den Agar nur mit dem Flüssigkeitstropfen berühren (Abbildung 1B).
   1. Vermeiden Sie es, den Agar mit der Pipettenspitze zu berühren, da dies den Agar beschädigen kann. Verwenden Sie eine Schablone, um den Spot gleichmäßig über verschiedene Schwarmagarplatten zu positionieren.
6. Mischen Sie für Antibiotikabehandlungen 30 μl Übernachtkultur P. aeruginosa aus Schritt 1.4 mit 6 μl 3 mg/ml Gentamycin, 10 μl 100 mg/ml Kanamycin oder 7,5 μl 100 mg/ml Fosfomycin. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort.
   1. 6 μl mit Antibiotika behandelter P. aeruginosa mit einer P20-Pipette pipettieren und an 6 äquidistanten Satellitenpositionen auf einem konzentrischen Kreis mit einem Radius von 2,8 cm um die Mitte der Schüssel spotten, indem man sich der Pipettenspitze in einem Winkel (10 bis 45°) von 2,5 cm über dem Fleckenbereich nähert und bis zum ersten Anschlag pipetpetiert. und berühren Sie den Agar nur mit dem Flüssigkeitstropfen (Abbildung 1D).
   2. Vermeiden Sie es, den Agar mit der Pipettenspitze zu berühren, da dies ihn beschädigen kann. Verwenden Sie aus Gründen der Konsistenz eine Plattierungsschablone.
7. Ersetzen Sie die durchsichtigen Deckel der Petrischale durch schwarze Deckel (Abbildung 2A).
8. Legen Sie die Schwarmagarplatten auf einen Scanner in einem auf 37 °C eingestellten Inkubator mit einem 10-Liter-Wasserbad, um eine Luftfeuchtigkeit von 75 % aufrechtzuerhalten (Abbildung 1E, Abbildung 2B). VORSICHT: Stören Sie nicht die gefleckten Zellen auf den schwärmenden Agarplatten. Halten Sie die Teller immer mit der Vorderseite nach oben.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des P. aeruginosa-Schwarmassays und der kollektiven Stressreaktion. (A) P. aeruginosa-Zellen werden über Nacht (16–18 h bis OD₆₀₀

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien
Bacto-Agar, dehydriert	BD Difco	214010	Für LB-Agar-Platte und Schwarm-Agar-Platte
Casaminosäuren	BD Difco	223050	Für Schwarmmedien
D-Glukose	Fisher Chemical	Nr. D16500	Dextrose. Für Schwarmmedien
Fosfomycin-Dinatriumsalz	Chemische Industrie in Tokio	Nr. F0889	Stammkonzentration: 200 mg / ml. Gelöst in ddH₂O
Gentamycinsulfat	Sigma-Aldrich	Nr. G1914	Stammkonzentration: 3 mg / ml. Gelöst in ddH₂O
Kanamycinsulfat	Sigma-Aldrich	60615	Stammkonzentration: 100 mg / ml. Gelöst in ddH₂O
LB-Müller	BD Difco	244620	Für LB-Bouillon und LB-Agar-Platten
Magnesiumsulfat-Heptahydrat	Sigma-Aldrich	230391	Für Schwarmmedien
Stämme
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn Labor	Nr. AFS27E.118	PA14-Stamm
Vorräte
Aluminiumoxid-Schleifpapier	3M	150 Geldstrafe	Für schwarze Deckel
Schwarzer Stoff	Joann	PRD7089	Schwarzer Stoff
Schwarze Sprühfarbe	Krilon	5592 Mattschwarz	Für schwarze Deckel
Erlenmeyerkolben	Kimax	26500	250 mL
Vorratsflaschen aus Glas	Pyrex	Artikel-Nr.: 13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
8 Zoll Kabelbinder	Gardner Bender	E173770	Zum Anbringen von schwarzem mattem Stoff
Petrischalen (100 mm x 15 mm)	Fischer	FB0875712	100 x 15 mm Polystyrolplatten
Holzstäbchen	Fischer	23-400-102	Zum Schlieren und Impfen von Bakterien
Ausrüstung
Autoklav	Markt Schmiede Branchen	STM-E	Zum Sterilisieren von Reagenzien
25 mL Pipette	USA Scientific, Inc.	1072-5410	Zum Pipettieren von 20 mL für Schwarmagarplatten
Luftentfeuchter	Frigidaire	FAD704DWD 70-Pint	Zur Aufrechterhaltung einer relativen Luftfeuchtigkeit im Raum von ca. 45 %
Brutkasten	VWR	89032-092	Für das Wachstum von Bakterien bei 37 °C
Isotemp Wasserbad	Fischer	Artikel-Nr.: 15-462-21Q	Zum Kühlen von Medien bis 55 °C
Laminar-Flow-Haube	Die Bäckerfirma	Nr. SG603A	Zum Trocknen von Platten
P-20 Pipette	Gilson	F123601	Fleckenbildung auf schwärmenden Agarplatten
Pipettier-Controller	BrandTech (Englisch)	Akku-Düse	Zum Pipettieren von 20 mL für Schwarmagarplatten