Induktion der Differenzierung von Vibrio parahaemolyticus in Schwarmzellen

Zusammenfassung

Quelle: Heering, J., et al. Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzellbildgebung von Vibrio parahaemolyticus , Schwimmer- und Schwarmzellen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die Induktion der Schwarmzelldifferenzierung in Vibrio parahaemolyticus unter Verwendung eines speziell präparierten Agarmediums. Durch die Manipulation von Umwelteinflüssen wie Eisenabbau, Kalziumergänzung und Oberflächenkontakt werden die Bakterien dazu angeregt, von ihrer Schwimmerform in längliche Schwarmzellen mit seitlichen Geißeln überzugehen. Diese differenzierten Zellen breiten sich über die feste Oberfläche aus und bilden charakteristische Schwarmfackeln, die eine erfolgreiche morphologische Veränderung anzeigen.

Protokoll

1. Induktion der Differenzierung von Schwarmerzellen

ANMERKUNG: In den folgenden Schritten wird beschrieben, wie die Differenzierung von V. parahaemolyticus in seinen Schwarmzelllebenszyklus induziert und die Proliferation auf festen Oberflächen stimuliert werden kann.

1. Suspendieren Sie 4 g Herzinfusions-Agar (HI) in 100 mL ddH₂O, um die Schwarmplatten vorzubereiten.

2. Kochen Sie die HI-Agar-Lösung vorsichtig in der Mikrowelle auf und schütteln Sie die Flasche von Zeit zu Zeit, bis sich das Pulver aufgelöst hat. Autoklav bei 121 °C für 20 min.

3. Nach dem Autoklavieren wird der HI-Agar auf 60-65 °C abgekühlt. 2,2'-Bipyridyl wird bis zu einer Endkonzentration von 50 μM (Stammlösung von 50 mM in 100 % Ethanol) zugegeben. CaCl₂ wird bis zu einer Endkonzentration von 4 mM (Stammlösung von 4 M in ddH₂O) zugegeben. Falls erforderlich, fügen Sie der Lösung Antibiotika hinzu, um die Plasmide zu erhalten.

ANMERKUNG: Wenn Sie vorhaben, ein induzierbares Plasmid zu verwenden, fügen Sie ein Induktionsmittel zu seiner Endkonzentration hinzu.

ACHTUNG: 2,2'-Bipyridyl: Akute Toxizität (oral, dermal, inhalativ). Verwenden Sie Handschuhe und eine Schutzbrille, wenn Sie mit dieser Chemikalie umgehen.

4. Gießen Sie 30 - 35 mL der endgültigen HI-Agar-Lösung in eine runde 150 mm Petrischale und lassen Sie den Agar erstarren.

5. Trocknen Sie die Agarplatte unmittelbar vor dem Spotten der Zellkultur mindestens 10 min lang bei 37 °C (oder bis alle Flüssigkeitsreste verschwunden sind, aber nicht länger) aufrecht mit offenem Deckel.
ANMERKUNG: Die Trocknungszeiten hängen stark vom verwendeten Inkubator ab, und stark getrocknete Platten lassen kein Schwärmen von V. parahaemolyticus zu. (Dieser Schritt ist sehr wichtig!) Die Teller müssen frisch verwendet werden und sollten nicht älter als 2 - 3 h sein. Alte Teller sind zu trocken, um das Schwärmen anzuregen.

6. Eine kleine Menge Zellen vom Rand einer einzelnen Kolonie in 5 ml Luria-Bertani (LB) Brühe impfen. Inkubieren Sie die Kultur unter Schütteln bei 37 °C, bis OD₆₀₀ = 0,8 erreicht ist, was in der Regel etwa 2-3 Stunden dauert. Danach sind die Zellen bereit, auf HI-Schwarm-Agarplatten aufgespottet zu werden.

7. Platzieren Sie 1 μl Zellkultur in der Mitte einer HI-Agar-Schwarmplatte (Abbildung 1A).

8. Lassen Sie den Fleck trocknen (Abbildung 1B).

9. Verschließen Sie die Platte mit durchsichtigem Plastikband und stellen Sie sicher, dass sie fest befestigt ist, da sie sich sonst während der Inkubation über Nacht lösen kann (Abbildung 1C).

ANMERKUNG: Es ist sehr wichtig, dass die Abdichtung perfekt ist. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen und Falten auf dem Klebeband beim Anbringen.

10. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 24 °C. Dies führt zur Bildung einer V. parahaemolyticus-Schwarmkolonie mit Schwarmfackeln, die sich von der Peripherie der Schwarmkolonie erstrecken (Abbildung 2).

Ergebnisse

Abbildung 1: Induktion der Swarmer-Differenzierung und Vorbereitung von Zellen für die mikroskopische Bildgebung. Vereinfachte Visualisierung des Arbeitsablaufs zur Herstellung von V. parahaemolyticus-Schwarmzellen un...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Medienkomponenten
LB mittel	Roth	X968.3
Difco Agar, granuliert	BD	214510	Zur Herstellung von LB-Agar mit LB-Medium
Difco Herz-Infusions-Agar	BD	244400	Zur Herstellung von HI-Agar-Schwarmplatten
Agarose NEEO, ultra Qualität	Roth	2267.3	Zur Vorbereitung von Agarose-Pads für die Mikroskopie
Zusatzstoffe
2,2'-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305-25G	Zur Herstellung von HI-Agar-Schwarmplatten
Calciumchlorid-Dihydrat	Roth	5239.1	Zur Herstellung von HI-Agar-Schwarmplatten
Hardware
Petrischale 150 mm x 20 mm mit Nocken	Sarstedt	82.1184.500	Zur Herstellung von HI-Agar-Schwarmplatten
Kelvitron t (B 6420)	Heraeus	-	Wird zum Trocknen von HI-Agar-Schwarmplatten verwendet