Dieses Video zeigt eine Methode zur Überwachung der bakteriellen Infektion und der Verabreichung von Effektorproteinen in Pflanzenzellen unter Verwendung der Komplementation des grün fluoreszierenden Superordners (sfGFP) in Kombination mit konfokaler Mikroskopie. Der Ansatz ermöglicht eine präzise Visualisierung der Effektortranslokation in das Zytosol der Wirtszelle.
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Methodenartikel
Überwachung der bakteriellen Infektion und der Verabreichung von Effektorproteinen in Pflanzenzellen
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26. September 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
ANMERKUNG: Alle Schritte werden, sofern nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.
1. Vorbereitung des Pflanzenmaterials (4 Wochen)
- Vorbereitung für die Pflanzen von Nicotiana benthamiana
- Säen Sie 2 Samen von N. benthamiana auf die Erdoberfläche jedes Topfes, decken Sie die Schale mit einer Plastikkuppel ab und lassen Sie die Samen in einer Wachstumskammer mit 25 °C und 60 % Luftfeuchtigkeit und einem 16/8-stündigen Hell-Dunkel-Photoperiodenzyklus keimen.
- Nach zwei Wochen solltest Du den kleinsten Sämling in jedem Topf aussuchen und entsorgen. Setze den Anbau der ....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Transgene Arabidopsis-Linien | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Raumzeitliche Überwachung von Pseudomonas syringae-Effektoren über Typ-III-Sekretion unter Verwendung von geteilten fluoreszierenden Proteinfragmenten. Pflanzenzelle. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69831 | |
| NU-sfGFP1-10 | ABRC | CS69832 | |
| PT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69833 | |
| MT-sfGFP1-10 | ABRC | CS69834 | |
| PX-sfGFP1-10 | ABRC | CS69835 | |
| ER-sfGFP1-10 | ABRC | CS69836 | |
| GO-sfGFP1-10 | ABRC | CS69837 | |
| PM-sfGFP1-10 | ABRC | CS69838 | |
| Organellen-zielgerichtetes sfGFP1-10OPT-Plasmid | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Raumzeitliche Überwachung von Pseudomonas syringae-Effektoren über Typ-III-Sekretion unter Verwendung von geteilten fluoreszierenden Proteinfragmenten. Pflanzenzelle. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| CYTO-sfGFP1-10 | Addgene | 97387 | |
| NU-sfGFP1-10 | Addgene | 97388 | |
| PT-sfGFP1-10 | Addgene | 97389 | |
| MT-sfGFP1-10 | Addgene | 97390 | |
| PX-sfGFP1-10 | Addgene | 97391 | |
| ER-sfGFP1-10 | Addgene | 97392 | |
| GO-sfGFP1-10 | Addgene | 97393 | |
| PM-sfGFP1-10 | Addgene | 97394 | |
| ER-sfKirsche1-10 | Addgene | 97403 | |
| ER-sfYFP1-10 | Addgene | 97404 | |
| CYTO-sfCFP1-10 | Addgene | 97405 | |
| sfGFP11-getaggter Gateway-kompatibler Vektor für T3SS-basiertes Effektor-Abgabesystem | Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Raumzeitliche Überwachung von Pseudomonas syringae-Effektoren über Typ-III-Sekretion unter Verwendung von geteilten fluoreszierenden Proteinfragmenten. Pflanzenzelle. 29 (7), 1571-1584 (2017) | ||
| pBK-GW-1-2 | Addgene | 98250 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Kanamycin (25 μg/ml) |
| pBK-GW-1-4 | Addgene | 98251 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Kanamycin (25 μg/ml) |
| pBK-GW-2-2 | Addgene | 98252 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Kanamycin (25 μg/ml) |
| pBK-GW-2-4 | Addgene | 98253 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Kanamycin (25 μg/ml) |
| pBG-GW-1-2 | Addgene | 98254 | pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Gentamycin (25 μg/ml) |
| pBG-GW-1-4 | Addgene | 98255 | pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Gentamycin (25 μg/ml) |
| pBG-GW-2-2 | Addgene | 98256 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Gentamycin (25 μg/ml) |
| pBG-GW-2-4 | Addgene | 98257 | pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Gentamycin (25 μg/ml) |
| Bakterienstämme | |||
| Agrobacterium tumefaciens GV3101 | Csaba Koncz und Jeff Schell, Der Promotor des TL-DNA-Gens 5 steuert die gewebespezifische Expression von chimären Genen, die von einem neuartigen binären Agrobacterium-Vektor getragen werden. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Beständig gegen Gentamycin (50 μg/ml) und Rifampicin (50 μg/ml) | ||
| Pseudomonas syringae pv. Tomaten CUCPB5500 | Kvitko, B. H. et al. Deletionen im Repertoire von Pseudomonas syringae pv. Tomaten-DC3000-Typ-III-Sekretionseffektorgene zeigen funktionelle Überlappungen zwischen den Effektoren. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Beständig gegen Rifampicin (100 μg/ml) | ||
| Medienkomponenten | |||
| Keimmedien für Pflanzen | 2.165g/L Murashige & Skoog Pulver, 10 g/L Saccharose in Wasser geben. Auf pH 5,8 einstellen und 2,2 g/L Phytagel hinzufügen. Automatisch kalben. | ||
| Murashige & Skoog Medium inkl. Vitamine | Duchefa Biochemie | Nr. M0222 | Bei 4 °C lagern. |
| Saccharose | Duchefa Biochemie | Nr. S0809 | |
| Gattung Phytagel | Sigma-Aldrich | Nr. P8169 | |
| LB Medien | 10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl zum Wasser geben. Für feste Medien 15 g/L Mikro-Agar hinzufügen. Autoklav. Lassen Sie die Lösung auf 55 °C abkühlen und fügen Sie bei Bedarf ein Antibiotikum hinzu. | ||
| Trypton | BD Biowissenschaften | 211705 | |
| Hefeextrakt | BD Biowissenschaften | 212750 | |
| NaCl | Duchefa Biochemie | Nr. S0520 | |
| Mikro-Agar | Duchefa Biochemie | M1002 | |
| King's B Medien | 10 g/L Protease Pepton #2, 1,5 g/L wasserfreies K2HPO4, 15 g/L Agar in Wasser. Autoklav. Auf 55 °C abkühlen lassen und sterile 15 ml/L Glycerin, 5 ml/L MgSO4 in das Medium geben. Füge bei Bedarf Antibiotika hinzu. | ||
| Proteose Pepton | BD Biowissenschaften | 212120 | |
| Wasserfreies K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 1551128 Alleinstellungsmerkmal | |
| Glycerin | Duchefa Biochemie | Nr. G1345 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Bacto Agar | BD Biowissenschaften | 214010 | |
| Mannitol-Glutamat (MG) flüssige Medien | Fügen Sie 10 g/l Mannitol, 2 g/l L-Glutaminsäure, 0,5 g/l KH2PO4, 0,2 g/l NaCl und 0,2 g/l MgSO4 dem Wasser hinzu. Auf pH 7 einstellen | ||
| Mannit | Duchefa Biochemie | Nr. M0803 | |
| L-Glutaminsäure | Duchefa Biochemie | Nr. G0707 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | NIST200B | |
| Infiltrations-Puffer | 10 mM MES (2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure), 10 mM MgCl2, 150 μM Acetosyringon. pH-Wert 5,6; Bereiten Sie vor Gebrauch einen frischen Puffer vor. | ||
| MES | Duchefa Biochemie | M1503 | Bereiten Sie 100 mM (pH 5,6) Brühe in Wasser vor. Filter sterilisieren. |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Bereiten Sie 100 mM Brühe in Wasser vor. Autoklav. |
| Acetosyringon | Sigma-Aldrich | D134406 | Bereiten Sie 150 mM Material in DMSO vor. |
| Geräte/Materialien für konfokale Mikroskope | |||
| 710 konfokales Laserscanning-System | Carl Zeiss | ||
| Axio observer Z1 inverses Mikroskop | Carl Zeiss |
