Überwachung der bakteriellen Infektion und der Verabreichung von Effektorproteinen in Pflanzenzellen

Zusammenfassung

Quelle: Lee, H. et. al., Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors, die während der Infektion von Bakterien abgegeben werden. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt eine Methode zur Überwachung der bakteriellen Infektion und der Verabreichung von Effektorproteinen in Pflanzenzellen unter Verwendung der Komplementation des grün fluoreszierenden Superordners (sfGFP) in Kombination mit konfokaler Mikroskopie. Der Ansatz ermöglicht eine präzise Visualisierung der Effektortranslokation in das Zytosol der Wirtszelle.

Protokoll

ANMERKUNG: Alle Schritte werden, sofern nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt.

1. Vorbereitung des Pflanzenmaterials (4 Wochen)

1. Vorbereitung für die Pflanzen von Nicotiana benthamiana
   1. Säen Sie 2 Samen von N. benthamiana auf die Erdoberfläche jedes Topfes, decken Sie die Schale mit einer Plastikkuppel ab und lassen Sie die Samen in einer Wachstumskammer mit 25 °C und 60 % Luftfeuchtigkeit und einem 16/8-stündigen Hell-Dunkel-Photoperiodenzyklus keimen.
   2. Nach zwei Wochen solltest Du den kleinsten Sämling in jedem Topf aussuchen und entsorgen. Setze den Anbau der Pflanzen unter den gleichen Wachstumsbedingungen fort, die in Schritt 1.1.1 für die Keimung angewendet wurden. Alle zwei Tage 1 l Wasser pro Tablett hinzufügen.
      ANMERKUNG: Die Wachstumsbedingungen für Pflanzen können von Labor zu Labor unterschiedlich sein. Befolgen Sie daher das regelmäßige Bewässerungsprotokoll, um die Pflanze in einem gesunden Zustand wachsen zu lassen.
   3. Setzen Sie die Pflanzen in einer Woche in ein neues Tablett um und ordnen Sie sie mit ausreichend Platz für weiteres Wachstum an. Züchte die Pflanzen unter den in Schritt 1.1.1 beschriebenen Bedingungen weiter, bis sie im Alter von 4 Wochen bereit sind, infiltriert zu werden.
      ANMERKUNG: Das Pflanzenwachstum kann je nach den Wachstumsbedingungen in den einzelnen Laboren unterschiedlich sein. Normalerweise stellen wir fest, dass die 4 Wochen alten N. benthamiana-Pflanzen etwa sechs Blätter tragen.
2. Vorbereitung für transgene Pflanzen aus Arabidopsis thaliana
   1. Beziehen Sie sich auf die Materialtabelle und bestellen Sie die transgenen Arabidopsis-Samen .
   2. Weichen Sie ~50 - 100 transgene Arabidopsis-Samen in 1 mL destilliertem Wasser ein und lagern Sie sie 3 Tage lang bei 4 °C im Dunkeln, um den Keimbeginn zu synchronisieren.
   3. Säen Sie ~2 - 3 Samen auf die Erdoberfläche einer Steckpflanzenschale und decken Sie die Schale mit einer Plastikkuppel ab. Lassen Sie die Samen bei 23 °C und 60 % Luftfeuchtigkeit und einem 10/14-stündigen Hell-Dunkel-Photoperiodenzyklus keimen.
      ANMERKUNG: Die Samen sollten homozygot sein. Wir empfehlen jedoch, das Vorhandensein des Transgens in der Charge erneut zu bestätigen. In diesem Fall sterilisieren Sie die Samen, indem Sie sie 2 Minuten lang mit 70 % Ethanol und 50 % Bleiche (ca. 2 % Hypochlorit) mit 0,05 % Triton X-100 für 5 Minuten waschen. Anschließend 5 - 6 x waschen mit sterilem doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O). Nach der Sterilisation 3 Tage lang bei 4 °C stratifizieren und auf pflanzliche Keimmedien mit 25 μg/l Hygromycin B auffüllen, um die transgenen Pflanzen auszuwählen.
   4. Nach einer Woche lässt Du nur noch eine Pflanze pro Stecker stehen und züchtest die Pflanzen unter den gleichen Wachstumsbedingungen wie in Schritt 1.2.3 weiter.
      ANMERKUNG: Vier Wochen alte Pflanzen wurden für die Infektion mit Pseudomonas syringae verwendet. Gießen Sie die Pflanzen jeden zweiten Tag, um die Pflanzen gesund zu halten.

2. Vorbereitung der Pseudomonas-Kultur (~1 Woche)

1. Aufbau des Plasmids für die Pseudomonas-Transformation
   1. Beziehen Sie sich auf die Materialtabelle und bestellen Sie den/die gewünschten(n) Vektor(en) des auf dem Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) basierenden Effektor-Verabreichungssystem-Vektors.
   2. Fügen Sie das interessierende Effektorgen mithilfe der ortsspezifischen Rekombinationsklonierung in den Effektor-Verabreichungsvektor ein.
      ANMERKUNG: Bei der Überwachung der subzellulären Lokalisation des Effektorproteins in voller Länge wird das Gen in voller Länge in pBK-GW-1-2 oder pBG-GW-1-2 eingefügt. Es ist auch möglich, pBK-GW-1-4 oder pBG-GW-1-4 mit 2x sfGFP11 (11. β-Strang von sfGFP) für ein erhöhtes Fluoreszenzsignal zu wählen. Im Falle eines partiellen Effektors ohne Signalpeptid verwenden Sie pBK-GW-2-2 oder pBK-GW-2-4.
2. Transformieren Sie das Plasmid, das einen Effektor trägt, der mit dem sfGFP11-Tag fusioniert ist, in P. syringae pv. Tomate (Pst) CUCPB5500 mit Standard-Elektroporation.
   ANMERKUNG: Bei Bedarf können auch andere Pseudomonas-Stämme verwendet werden. Das sfGFP11-Tag-System ist für eine breite Palette von Vektoren ausgelegt, und die Genexpression des Effektors wird durch den AvrRpm1-Promotor reguliert, der z.B. mit Pseudomonas fluorescens (EthAn) vergleichbar ist.
3. Verteilen Sie die transformierten Bakterienzellen vorsichtig auf der Oberfläche der King's B-Agarplatten mit 100 μg/mL Rifampicin und 25 μg/mL Kanamycin oder 25 μg/ml Gentamycin. 2 Tage lang bei 28 °C inkubieren.
4. Eine Kolonie wird in King's B Flüssigmedium mit Antibiotika geimpft, die für den verwendeten Vektor geeignet sind, und die Zellen über Nacht bei 28 °C und Schütteln bei 200 U/min gezüchtet.
5. Stelle eine Glycerin-Brühe her. Autoklaviertes Glycerin bis zu einer Endkonzentration von 50 % zugeben und bei -80 °C lagern.

3. Transiente Expression von Organellen-gerichtetem sfGFP1-10^OPT (1-10^th β-Strang von sfGFP) in N. benthamiana (4 Tage)

1. Vorbereitung der Agrobacterium-Kultur
   1. Bestellen Sie den/die gewünschte(n) Vektor(en) des/der organellengerichteten sfGFP1-10^OPT-Plasmid (s) (siehe Materialtabelle).
   2. Transformieren Sie das/die Plasmid(e) in Zellen des Agrobacterium tumefaciens-Stammes GV3101. Züchten Sie die Zellen auf Luria-Bertani (LB)-Agarmedium, das mit 50 μg/ml Kanamycin und 50 μg/ml Rifampicin bei 28 °C für 2 Tage ergänzt wurde.
   3. Aus einer einzigen Kolonie auf dem LB-Agar-Medium werden die Zellen in 5 ml flüssiges LB-Medium geimpft, das mit 50 μg/mL Kanamycin und 50 μg/ml Rifampicin ergänzt wird. Züchten Sie die Zellen über Nacht bei 28 °C und schütteln Sie sie bei 200 U/min.
   4. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 10 min. Gießen Sie das überstehende Medium ab und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml frisch hergestelltem Infiltrationspuffer.
   5. Messen Sie die Menge von Agrobacterium , indem Sie den Wert der optischen Dichte (OD) bei einer Extinktion von 600 nm (Abs 600 nm) erhalten. Stellen Sie den OD₆₀₀ der Bakterien mit Infiltrationspuffer auf 0,5 ein.
      HINWEIS: 1 ml Suspension reicht aus, um an zwei Stellen zu infiltrieren.
   6. Lassen Sie die Kultur bei Raumtemperatur auf einer sanften Wippe 1 - 5 h warten, bevor Sie infiltrieren.
   7. Stechen Sie ein Loch in die Mitte der Blätter, die mit einer 10-μl-Spitze infiltriert werden sollen. Verwenden Sie eine nadellose 1-ml-Spritze, um die Agrobacterium-Suspensionen zu infiltrieren. Etwa 500 μl der in Schritt 3.1.5 hergestellten Suspensionen werden vorsichtig und langsam über die Spritze in die blattadaxiale Seite injiziert. Wiederholen Sie die Infiltration auf mindestens drei verschiedenen Pflanzen für experimentelle Replikate.
      ANMERKUNG: Aus Gesundheits- und Sicherheitsgründen sollte während der Infiltration ein Augenschutz getragen werden.
   8. Wischen Sie die restliche Bakteriensuspension auf den Blättern ab und markieren Sie die Grenze des infiltrierten Bereichs.
   9. Halte die infiltrierten Pflanzen 2 Tage lang unter den gleichen Wachstumsbedingungen wie in Schritt 1.1.1.

4. Inokulation von Pseudomonas (4 Tage)

1. Den transformierten Pseudomonas-Stamm aus dem Glycerinbestand in Schritt 2.5 auf King's B-Agar-Medium mit den entsprechenden Antibiotika bei 28 °C für 2 Tage durchstreifen.
   ANMERKUNG: Die Gesundheit von Pseudomonas ist sehr kritisch. Wenn sich die Kolonien nicht gut bilden, streifen Sie die Zellen erneut oder vermehren Sie die Zellen im flüssigen Medium des Königs, bevor Sie fortfahren.
2. Eine Schleife voller Pseudomonas-Zellen in flüssigem Mannitol-Glutamat (MG)-Medium bei 28 °C inokulieren und über Nacht bei 200 U/min schütteln.
3. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 3.000 x g für 10 min. Gießen Sie das überstehende Medium ab, resuspendieren Sie das Pellet in 10 mM MgCl₂ und stellen Sie den OD₆₀₀ auf 0,02 (1 x 10⁷ KBE/ml) für N. benthamiana-Blätter und auf 0,002 (1 x 10⁶ KBE/ml) für Arabidopsis-Blätter ein.
4. Für N. benthamiana infiltrieren Sie die Pseudomonas-Suspension in den Bereich der Blätter, in den das Agrobacterium-tragende sfGFP1-10^{OPT-Konstrukt} 2 Tage zuvor infiltriert wurde (wie in Schritt 3.1.7). Für das transgene Arabidopsis sfGFP1-10^OPT infiltrieren Sie die Pseudomonas-Suspension in zwei 4 Wochen alte, kurze, taggewachsene Blätter.
   ANMERKUNG: Für experimentelle Replikate werden mindestens drei Pflanzen benötigt.

5. Beobachtung des sfGFP-Signals mittels konfokaler Mikroskopie (1 Tag)

1. Schneiden Sie die Blattscheibe aus den mit Pseudomonas beimpften Blättern aus. Zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infiltration von Pseudomonas werden zwei 2 cm^große 2-Blatt-Scheiben von der einzelnen Pflanze mit einem konfokalen Laserscanning-System mit einem C-Apochromat-Wasserimmersionsobjektiv mit 40X/1,2 numerischer Apertur (NA) oder einem C-Apochromat-Ölimmersionsobjektiv mit 63X/0,8 NA abgebildet. Um zu vermeiden, dass tote Zellen durch Verwundung getötet werden, beobachten Sie die Zellen außerhalb des Infiltrationslochs.
2. Beginnen Sie die Beobachtung mit einer niedrigen Leistungseinstellung des 488-nm-Argonlasers. Erhöhen Sie die Laserleistung, um sfGFP zu erkennen.
   ANMERKUNG: In der Regel verwenden wir 2 - 15% der Laserintensität, um das Fluoreszenzsignal zu detektieren. Die Einstellungen für Laserleistung und -erkennung sollten jedoch basierend auf dem Mikroskopiesystem des Benutzers angepasst werden. Hier wurden die Emissionsfilter auf 520 - 550 nm eingestellt. Die toten Zellen emittieren unter der 488-nm-Laseranregung oft eine Autofluoreszenz. Daher sollte als Negativkontrolle derselbe Effektor ohne den sfGFP11-Tag infiltriert und unter denselben Beobachtungsbedingungen beobachtet werden. Darüber hinaus kann eine hohe Laseranregung eine Chlorophyll-Autofluoreszenz induzieren. Passen Sie daher die Laserintensität mit den Kontrollpflanzenzellen so an, dass keine Chlorophyll-Autofluoreszenz induziert wird.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Transgene Arabidopsis-Linien			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Raumzeitliche Überwachung von Pseudomonas syringae-Effektoren über Typ-III-Sekretion unter Verwendung von geteilten fluoreszierenden Proteinfragmenten. Pflanzenzelle. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-sfGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-sfGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-sfGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-sfGFP1-10	ABRC	CS69838
Organellen-zielgerichtetes sfGFP1-10OPT-Plasmid			Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Raumzeitliche Überwachung von Pseudomonas syringae-Effektoren über Typ-III-Sekretion unter Verwendung von geteilten fluoreszierenden Proteinfragmenten. Pflanzenzelle. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	Addgene	97387
NU-sfGFP1-10	Addgene	97388
PT-sfGFP1-10	Addgene	97389
MT-sfGFP1-10	Addgene	97390
PX-sfGFP1-10	Addgene	97391
ER-sfGFP1-10	Addgene	97392
GO-sfGFP1-10	Addgene	97393
PM-sfGFP1-10	Addgene	97394
ER-sfKirsche1-10	Addgene	97403
ER-sfYFP1-10	Addgene	97404
CYTO-sfCFP1-10	Addgene	97405
sfGFP11-getaggter Gateway-kompatibler Vektor für T3SS-basiertes Effektor-Abgabesystem	Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, S. P. Raumzeitliche Überwachung von Pseudomonas syringae-Effektoren über Typ-III-Sekretion unter Verwendung von geteilten fluoreszierenden Proteinfragmenten. Pflanzenzelle. 29 (7), 1571-1584 (2017)
pBK-GW-1-2	Addgene	98250	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Kanamycin (25 μg/ml)
pBK-GW-1-4	Addgene	98251	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Kanamycin (25 μg/ml)
pBK-GW-2-2	Addgene	98252	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Kanamycin (25 μg/ml)
pBK-GW-2-4	Addgene	98253	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Kanamycin (25 μg/ml)
pBG-GW-1-2	Addgene	98254	pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Gentamycin (25 μg/ml)
pBG-GW-1-4	Addgene	98255	pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Gentamycin (25 μg/ml)
pBG-GW-2-2	Addgene	98256	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Gentamycin (25 μg/ml)
pBG-GW-2-4	Addgene	98257	pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Beständig gegen Gentamycin (25 μg/ml)
Bakterienstämme
Agrobacterium tumefaciens GV3101			Csaba Koncz und Jeff Schell, Der Promotor des TL-DNA-Gens 5 steuert die gewebespezifische Expression von chimären Genen, die von einem neuartigen binären Agrobacterium-Vektor getragen werden. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Beständig gegen Gentamycin (50 μg/ml) und Rifampicin (50 μg/ml)
Pseudomonas syringae pv. Tomaten CUCPB5500			Kvitko, B. H. et al. Deletionen im Repertoire von Pseudomonas syringae pv. Tomaten-DC3000-Typ-III-Sekretionseffektorgene zeigen funktionelle Überlappungen zwischen den Effektoren. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Beständig gegen Rifampicin (100 μg/ml)
Medienkomponenten
Keimmedien für Pflanzen			2.165g/L Murashige & Skoog Pulver, 10 g/L Saccharose in Wasser geben. Auf pH 5,8 einstellen und 2,2 g/L Phytagel hinzufügen. Automatisch kalben.
Murashige & Skoog Medium inkl. Vitamine	Duchefa Biochemie	Nr. M0222	Bei 4 °C lagern.
Saccharose	Duchefa Biochemie	Nr. S0809
Gattung Phytagel	Sigma-Aldrich	Nr. P8169
LB Medien			10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl zum Wasser geben. Für feste Medien 15 g/L Mikro-Agar hinzufügen. Autoklav. Lassen Sie die Lösung auf 55 °C abkühlen und fügen Sie bei Bedarf ein Antibiotikum hinzu.
Trypton	BD Biowissenschaften	211705
Hefeextrakt	BD Biowissenschaften	212750
NaCl	Duchefa Biochemie	Nr. S0520
Mikro-Agar	Duchefa Biochemie	M1002
King's B Medien			10 g/L Protease Pepton #2, 1,5 g/L wasserfreies K2HPO4, 15 g/L Agar in Wasser. Autoklav. Auf 55 °C abkühlen lassen und sterile 15 ml/L Glycerin, 5 ml/L MgSO4 in das Medium geben. Füge bei Bedarf Antibiotika hinzu.
Proteose Pepton	BD Biowissenschaften	212120
Wasserfreies K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128 Alleinstellungsmerkmal
Glycerin	Duchefa Biochemie	Nr. G1345
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Bacto Agar	BD Biowissenschaften	214010
Mannitol-Glutamat (MG) flüssige Medien			Fügen Sie 10 g/l Mannitol, 2 g/l L-Glutaminsäure, 0,5 g/l KH2PO4, 0,2 g/l NaCl und 0,2 g/l MgSO4 dem Wasser hinzu. Auf pH 7 einstellen
Mannit	Duchefa Biochemie	Nr. M0803
L-Glutaminsäure	Duchefa Biochemie	Nr. G0707
KH2PO4	Sigma-Aldrich	NIST200B
Infiltrations-Puffer			10 mM MES (2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure), 10 mM MgCl2, 150 μM Acetosyringon. pH-Wert 5,6; Bereiten Sie vor Gebrauch einen frischen Puffer vor.
MES	Duchefa Biochemie	M1503	Bereiten Sie 100 mM (pH 5,6) Brühe in Wasser vor. Filter sterilisieren.
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Bereiten Sie 100 mM Brühe in Wasser vor. Autoklav.
Acetosyringon	Sigma-Aldrich	D134406	Bereiten Sie 150 mM Material in DMSO vor.
Geräte/Materialien für konfokale Mikroskope
710 konfokales Laserscanning-System	Carl Zeiss
Axio observer Z1 inverses Mikroskop	Carl Zeiss