Gezielte Isolierung von Bakterienkolonien durch lichtstrukturierten Hydrogelabbau

Abstract

Quelle: Fattahi, N., et al. Photoabbaubare Hydrogel-Grenzflächen für das Screening, die Selektion und die Isolierung von Bakterien. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt die Extraktion von Bakterienkolonien aus einem photoabbaubaren Hydrogel mit Hilfe von UV-Licht. Eine bestimmte Kolonie wird ausgewählt, und eine gemusterte Lichtexposition soll den lokalen Hydrogelabbau initiieren. Nach dem Einstellen der Lichtintensität und -dauer wird das UV-Licht angewendet, wodurch die Kolonie freigesetzt wird. Die Kolonie wird dann durch einen Schlauch aspiriert und zur nachgeschalteten Analyse in ein Rohr überführt.

Protocol

1. Bakterienstämme und Kulturprotokolle

1. Streifen von Bakterienkolonien auf Agarplatten, ergänzt mit geeigneten Nährmedien. In diesem Bericht wird B. subtilis (Stamm 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) auf ATGN (0,079 M KH₂PO₄ (Kaliumdihydrogenphosphat), 0,015 M (NH₄)₂SO₄ (Ammoniumsulfat), 0,6 mM MgSO 4,7H₂O (Magnesiumsulfat-Heptahydrat), 0,06 mM CaCl _{2,2H 2}O (Calciumchlorid-Dihydrat), 0,0071 mM MnSO₄·H₂O (Mangan(II)-sulfat-Monohydrat), 0,125 M FeSO_{4,7H 2}O (Eisensulfat-Heptahydrat), 28 mM Glukose, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L Agar) Agarplatten ergänzt mit 100 μg/ml Spectinomycin und E. coli (Stamm 25922, ATCC) auf ATGN-Agarplatten ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin.
   HINWEIS: Frühere Berichte über die Verkapselung und Freisetzung von Hydrogelen mit diesen Materialien verwendeten A. tumefaciens C58-Zellen
2. Wählen Sie die gewünschten Völker aus ATGN-Agarplatten aus und beginnen Sie mit Übernachtkulturen. Für die hier verwendeten E . coli - und B. subtilis-Stämme bei 37 °C und Schütteln bei 215 U/min in ATGN-Flüssigmedium für 24 h kultivieren. Lagern Sie die Zellkulturen in 50% Glycerin bei -80 °C bis zur zukünftigen Verwendung.
3. Kolonien beider Stämme werden mit sterilen Impfösen aus Glycerinbeständen entnommen und 24 Stunden lang bei 37 °C und 215 U/min in ATGN-Flüssigmedien inkubiert.

2. Vorbereitung des für die Hydrogelbildung benötigten Materials

1. Synthese von photoabbaubarem PEG-o-NB-diacrylat (Poly(ethylenglykol)-ortho-nitrobenzyldiacrylat)
   HINWEIS: Die hauseigene Synthese des PEG-o-NB-Diacrylats wurde ausführlich beschrieben und bereits berichtet. Da es sich bei der Synthese um eine Routine handelt, kann sie auch aus einer chemischen Syntheseanlage ausgelagert werden.
2. Vernetzungs-Puffer
   1. Nehmen Sie das Rezept für das gewählte Medium für den Bakterienstamm und bereiten Sie das Medium mit 2x Nährstoffen vor. Phosphat, z. B. NaH₂PO₄ (Natriumdihydrogenphosphat), wird dem Medium bis zu einer Endkonzentration von 100 mM zugegeben. Stellen Sie dann den pH-Wert mit 5 M NaOH (Natriumhydroxid) (wässrig) auf 8 ein.
   2. Sterilisieren Sie die Pufferlösung und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.
      HINWEIS: Lassen Sie alle in den Medien vorhandenen Übergangsmetalle weg, da diese Metalle die Oxidation der Thiole zu Disulfiden katalysieren.
3. PEG-o-NB-Diacrylat-Lösung
   1. Für jedes mg des aliquoten PEG-o-NB-diacrylat-Pulvers (3.400 Da Molekulargewicht) werden 3,08 μl Reinstwasser zugegeben, um eine Konzentration von 49 mM PEG-o-NB-diacrylat (98 mM Acrylatkonzentration) zu erreichen.
   2. Reiben Sie die Lösung, bis sie gut vermischt ist, und lagern Sie diese Lösung bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.
4. 4-armige PEG-Thiol-Lösung
   1. Für die Herstellung von 4-armigem PEG-Thiol (10.000 Da Molekulargewicht) fügen Sie 4 μl Reinstwasser pro mg Pulver hinzu, um eine Konzentration von 20 mM (80 mM Thiolkonzentration) zu erreichen.
   2. Wirbeln Sie diese Lösung auf, bis sie gut vermischt ist, und lagern Sie diese Lösung bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C.

3. Herstellung von perfluoralkylierten (nicht reaktiven) Deckgläsern

1. Legen Sie bis zu 5 Objektträger (25 mm x 75 mm x 1 mm) in eine Versandtasche aus Polypropylen. Beschallen Sie die Objektträger 20 Minuten lang mit einer 2%igen (w/v) Reinigungslösung (Materialtabelle).
2. Spülen Sie die Objektträger dreimal mit Reinstwasser ab und beschallen Sie die Objektträger dann 20 Minuten lang mit Wasser. Trocknen Sie die Objektträger mit einem Strahl N₂ (Stickstoff).
3. Plasmareinigung (siehe Materialtabelle) auf beiden Seiten der Objektträger gemäß dem Protokoll in Abschnitt 4.1 für 2 min.
4. Legen Sie die plasmagereinigten Objektträger zurück in den Objektträgerversand und füllen Sie den Behälter mit einer 0,5%igen (v/v) Lösung von Trichlor(1H, 1H, 2H, 2H,-Perfluoroctyl)silan in Toluol. Lassen Sie diese Objektträger 3 h lang bei Raumtemperatur (RT) funktionalisieren.
5. Nachdem die Objektträger funktionalisiert sind, spülen Sie die Objektträger im Objektträgerversand zuerst mit Toluol und dann mit Ethanol (dreimal mit jedem Lösungsmittel). Anschließend wird jeder funktionalisierte Objektträger mit einem Strahl von N₂ getrocknet.

4. Herstellung von Thiol-funktionalisierten (Basis-)Deckgläsern

1. Reinigung der Glasdeckgläser mit einem Plasmareiniger
   1. Legen Sie 18 mm x 18 mm Deckgläser in eine Petrischale. Stellen Sie dann die Petrischale in eine Plasmareinigerkammer und schalten Sie die Stromversorgung des Plasmareinigers ein.
   2. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, um die Luft in der Kammer zu reinigen, bis das Manometer 400 mTorr anzeigt.
   3. Öffnen Sie das Dosierventil, um Luft in die Kammer zu lassen, bis das Manometer einen konstanten Druck (800-1000 mTorr) erreicht. Wählen Sie dann RF mit dem "Hi"-Modus und belichten Sie die Deckgläser für 3 Minuten.
   4. Schalten Sie nach 3 Minuten den HF-Modus und die Vakuumpumpe aus.
   5. Nehmen Sie die Petrischale aus der Kammer, klappen Sie die Deckgläser um, legen Sie sie wieder in die Kammer zum Plasma und legen Sie die andere Seite des Glasdeckglases frei.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2 bis 4.1.4, um die unbehandelte Seite des Glasdeckglases mit Plasma zu reinigen.
   7. Nehmen Sie nach Abschluss des Vorgangs die Petrischale aus der Kammer und schalten Sie den Plasmareiniger und die Vakuumpumpe aus.
2. Reinigung und Hydroxylierung der Deckgläser mit Piranha-Lösung
   HINWEIS: Standard-Piranha-Reinigungsprotokolle können verwendet werden, um Glasschlicker zu reinigen und zu hydroxylieren. Piranha-Lösung ist ein 30:70 (v/v) Gemisch aus H₂O₂ (Wasserstoffperoxid) und H₂SO₄ (Schwefelsäure). Es können auch alternative Methoden zur Reinigung von Glasdeckgläsern verwendet werden.
   ACHTUNG: Piranha-Lösung ist stark korrosiv und explosiv mit organischen Lösungsmitteln und sollte mit äußerster Vorsicht gehandhabt werden. Es sollten geeignete Sicherheits- und Eindämmungsmaßnahmen ergriffen werden, wie z. B. die Verwendung geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, chemikalienbeständige Schürze, Schutzbrille, Gesichtsschutz, säurebeständige Butylhandschuhe). Alle Gläser und Arbeitsflächen, die mit Piranha-Lösung in Berührung kommen, sollten vor der Verwendung sauber, trocken und frei von organischen Rückständen sein. Piranha-Lösung sollte niemals in einem teilweise geschlossenen oder geschlossenen Behälter gelagert werden.
   1. Stellen Sie eine saubere Glasschale von 100 mm x 50 mm auf eine Heizplatte mit einstellbarer Rührgeschwindigkeit unter einen Abzug und geben Sie 14 mL H₂SO₄ in die Schale.
   2. Platzieren Sie vorsichtig einen kleinen, teflonbeschichteten Magnetrührstab mit einer teflonbeschichteten Pinzette in der Schale. Drehen Sie dann den Rührer langsam, um ein Verspritzen der Säure zu vermeiden.
   3. Geben Sie dann vorsichtig 6 ml H₂O₂ in die Schale und lassen Sie die Lösung gut vermischt werden.
   4. Schalten Sie den Rührstab aus und entfernen Sie dann den Rührstab mit der Pinzette aus der Schüssel. Legen Sie anschließend die Deckgläser vorsichtig mit der Pinzette in die Schale und stellen Sie die Temperatur auf 60–80 °C ein.
   5. Entfernen Sie nach 30 Minuten vorsichtig die Deckgläser mit der Pinzette und tauchen Sie sie zweimal in deionisiertes Wasser (DI), um die restliche Piranha-Lösung abzuwaschen.
   6. Bewahren Sie die Deckgläser nach dem Spülen mit Wasser bis zur weiteren Verwendung in DI-Wasser bei RT auf.
   7. Schalten Sie die Herdplatte aus und lassen Sie die Piranha-Lösung abkühlen.
   8. Um die Piranha-Lösung zu entsorgen, stellen Sie die 100 mm x 50 mm große Glasschale mit der abgekühlten Piranha-Lösung vorsichtig in ein größeres, leeres Glasbecherglas mit einem Volumen von mindestens 1,5 l. Fügen Sie dann 1 l Wasser zum Verdünnen hinzu und fügen Sie Natriumbicarbonatpulver hinzu, um es zu neutralisieren. Beachten Sie, dass Natriumbicarbonat Blasenbildung und Wärmeentwicklung verursacht und sehr langsam hinzugefügt werden sollte. Andernfalls kann das Blasen zum Verspritzen der Säure führen. Wenn die weitere Zugabe von Natriumbicarbonat keine Blasenbildung verursacht, überprüfen Sie den pH-Wert mit pH-Papier, um sicherzustellen, dass es neutralisiert wurde. Sobald die Lösung neutralisiert und abgekühlt ist, kann sie in die Spüle gegossen werden.
3. Thiol-Funktionalisierung der Deckgläser
   1. Bereiten Sie eine 5%ige (v/v) Lösung von 269 mM (3-Mercaptopropyl)-trimethoxysilan (MPTS)-Lösung in trockenem Toluol vor.
   2. Geben Sie 10 ml der Lösung in einzelne konische 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Legen Sie ein gereinigtes Deckglas in jede Tube und tauchen Sie es in die Lösung.
      HINWEIS: Ein Deckglas pro 50-ml-Röhrchen wird verwendet, um die Thiolierung auf beiden Seiten des Substrats zu gewährleisten, ohne durch andere Substrate gestört zu werden.
   3. Nach 4 Stunden waschen Sie jedes Deckglas (vier Wäschen pro Deckglas) mit Toluol, einem 1:1 (v/v) Ethanol:Toluol-Gemisch und Ethanol.
      HINWEIS: Dies geschieht, indem jedes Deckglas nacheinander in konische Zentrifugenröhrchen getaucht wird, die die genannten Lösungen enthalten.
   4. Tauchen Sie das Substrat nach dem Spülen in Ethanol und lagern Sie es bis zur weiteren Verwendung bei 4 °C.
      HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Deckgläser kann diese Methode mühsam werden, da die Deckgläser einzeln behandelt werden müssen. Für mehrere Deckgläser können Columbia-Gläser verwendet werden, auf die mehrere Deckgläser gleichzeitig passen.

5. Herstellung von Silizium-Mikrotiter-Arrays

1. Parylene-Beschichtung: Verwenden Sie das in früheren Forschungsartikeln beschriebene Standardprotokoll, um Siliziumwafer mit Parylene zu beschichten.
2. Mikrofabrikation: Befolgen Sie das von Barua et al. beschriebene Protokoll, um das Mikrotiterarray zu entwerfen und herzustellen. ​

6. Hydrogel-Bildung

1. Bildung von Hydrogelen in großen Mengen auf Glasdeckgläsern
   1. Hydrogel-Vorläuferlösung: Geben Sie 12,5 μl des Vernetzungspuffers in ein 0,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, gefolgt von 5,6 μl PEG-o-NB-Diacrylatlösung. Zum Schluss fügen Sie der Mischung 6,9 μl 4-armige PEG-Thiol-Lösung hinzu.
      HINWEIS: Die Zugabe des 4-armigen PEG-Thiols zur Mischung leitet die Vernetzungsreaktion ein. Daher sollte die Hydrogel-Vorläuferlösung unmittelbar nach dem Mischen verwendet werden.
   2. Für die Zellverkapselung in der Hydrogel-Vorläuferlösung befolgen Sie die Schritte 6.1.3-6.1.9.
   3. Für die Zellverkapselung wird vor Schritt 6.1.1 der Vernetzungspuffer mit der gewünschten Zelldichte beimpft. Wie bereits berichtet19, wurde beobachtet, dass eine Zelldichte von 7,26 × 10⁷ KBE/ml im Vernetzungspuffer mit einer Dichte von ~ 90 Zellen/^mm2 korreliert, die über das Hydrogel verkapselt ist.
   4. Legen Sie das thiolierte Basisdeckglas auf eine saubere Petrischale. Platzieren Sie zwei Abstandshalter (siehe Materialtabelle) auf den beiden gegenüberliegenden Seiten des Deckglases.
      HINWEIS: Die Thiolfunktionalisierung der Deckgläser ist für die kovalente Bindung des Hydrogels an die Deckglasoberfläche erforderlich. Dies geschieht durch die Reaktion von Thiolgruppen auf der Oberfläche und den in der Hydrogel-Vorläuferlösung vorhandenen Acrylatgruppen.
   5. Befestigen Sie die Abstandshalter auf dem Basisdeckglas, indem Sie die Abstandshalter an die Petrischale kleben.
   6. Das gewünschte Volumen der Vorläuferlösung wird auf einen nicht reaktiven, perfluoralkylierten Glasobjektträger pipettiert.
   7. Legen Sie den Objektträger aus perfluoralkyliertem Glas auf das Deckglas (Abbildung 1C). Warten Sie 25 Minuten bei RT, bis die Hydrogelbildung abgeschlossen ist.
   8. Entfernen Sie nach der Gelierung vorsichtig den perfluoralkylierten Objektträger. Das Hydrogel bleibt an dem Basisdeckglas haften. ​
      HINWEIS: Verwenden Sie für Deckgläser mit einer Größe von 18 mm x 8 mm, um eine 12,7 μm dicke Membran zu erhalten, ~7 μl der Vorläuferlösung (Abbildung 1A, B). Die Verwendung größerer Mengen der Vorläuferlösung kann zu einem Hydrogel unter dem Basisdeckglas führen. Dies kann dazu führen, dass das Basisdeckglas an der Petrischale kleben bleibt und beim Versuch, es zu entfernen, bricht. Auch Hydrogelrückstände unter dem Deckglas sind für die Mikroskopie problematisch. Eine schonende Entfernung des nicht reaktiven perfluoralkylierten Glasobjektträgers ist erforderlich, da eine schnelle Entfernung das Hydrogel beschädigen kann.
   9. Legen Sie das Substrat in eine 60 mm x 15 mm große Petrischale in das angegebene Kulturmedium. Hier wurden ATGN-Medien supplementiert mit 100 μg/mL Spectinomycin für B. subtilis oder 100 μg/mL Ampicillin für E.coli bei 37 °C für 24 h Kulturzeiten verwendet.

7. Materialvorbereitung für die Zellextraktion

1. Vorbereitung des PDMS (Polydimethylsiloxan) Halters
   1. Kleben Sie einen Stapel von zehn Deckgläsern 18 x 18 mm zusammen und kleben Sie diesen Stapel Deckgläser auf den Boden einer Petrischale.
   2. Zur Herstellung von PDMS-Haltern mischen Sie PDMS-Vorläufer und Härter im Volumenverhältnis 10:1 in einem Kunststoffbecher, entgasen Sie das Gemisch in einem Vakuumexsikkator und gießen Sie das Gemisch dann in die Petrischale.
   3. PDMS 90 min lang bei 80 °C aushärten. Schneiden Sie dann um den abgeklebten Block herum, um den PDMS-Halter zu entfernen, und platzieren Sie den PDMS-Halter auf einem Objektträger, um die Handhabung für die Mikroskopie zu erleichtern.
2. Vorbereitung von Mikrospritzen und Schläuchen
   1. Schneiden Sie 20 cm PTFE-Schlauch (Polytetrafluorethylen) (0,05 Zoll Innendurchmesser) ab und befestigen Sie ein Ende des Schlauchs an einer 100-μl-Mikroliterspritze.
      HINWEIS: Vermeiden Sie für die Extraktion die Verwendung von Pipetten, da das Entnehmen der freigesetzten Zellen über eine Pipettenspitze die Hydrogeloberfläche beschädigen und zu einer Kontamination führen kann.

8. Hydrogel-Abbau mit dem Werkzeug für die gemusterte Beleuchtung

1. Schalten Sie das Mikroskop ein (siehe Materialtabelle). Aktivieren Sie dann das Werkzeug für die gemusterte Beleuchtung (siehe Materialtabelle).
2. Schalten Sie das analoge und digitale Steuermodul der 365-nm-LED-Lichtquelle ein. Schalten Sie anschließend das Steuermodul für LED-Lichtquellen ein.
3. Öffnen Sie die Mikroskopsoftware und die Software für das Werkzeug für die gemusterte Beleuchtung. Wenn das Hardwarekonfigurationsfenster geöffnet ist, wählen Sie die Schaltfläche Laden aus.
   HINWEIS: Hier werden drei Geräte geladen. (Kamera eines Drittanbieters, ein Steuermodul und das Werkzeug für gemusterte Beleuchtung)
4. Drücken Sie die Start-Taste. Das Softwarefenster für die Lichtstrukturierung wird nun geöffnet. Wählen Sie die erste Option, die Schaltfläche Gerätesteuerung, in der linken Seitenleiste des Fensters aus.
5. Kalibrieren Sie das Werkzeug für die gemusterte Beleuchtung.
   HINWEIS: Die Kalibrierung muss mit demselben Mikroskopobjektiv und Filter durchgeführt werden, die für die Lichtbelichtung verwendet werden.
   1. Stellen Sie das Mikroskopobjektiv auf eine 10-fache Vergrößerung ein.
      HINWEIS: Diese Vergrößerung ermöglicht einen ausreichenden Arbeitsabstand zwischen der Mikroskoplinse und der Probenoberfläche. Es ermöglicht auch die Überwachung und Aufzeichnung des Entnahmevorgangs in Echtzeit durch das Bildfenster.
   2. Stellen Sie das Mikroskopobjektiv und den Filter auf die Einstellungen für die Belichtung ein und platzieren Sie den Kalibrierspiegel unter dem Mikroskop.
   3. Drücken Sie im Fenster "Gerätesteuerung" auf die Registerkarte "LED-Steuerung". Schalten Sie LED #1 ein und stellen Sie die Lichtintensität auf die gewünschte Zahl ein. In Standard-Extraktionsexperimenten ist dieser Wert auf 60 % eingestellt.
   4. Drücken Sie auf die Registerkarte mit dem Produktnamen des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs im Fenster "Gerätesteuerung". Drücken Sie dann die Schaltfläche Raster anzeigen.
      HINWEIS: Auf den Kalibrierspiegel wird ein Gittermuster projiziert.
   5. Passen Sie den Mikroskopfokus und die Kamerabelichtung an, um eine hohe Bildqualität des Rasters zu erzielen, und drehen Sie die Kamera, um die Rasterlinien bei Bedarf parallel zum Rahmen des Kamerafensters auszurichten.
   6. Wählen Sie die Schaltfläche Kalibrierungsassistent auf der Registerkarte mit dem Produktnamen des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs und befolgen Sie die Anweisungen der Software in diesem Fenster. HINWEIS: Ein Fenster zur Einrichtung einer Kamera eines Drittanbieters wird geöffnet.
   7. Das Fenster zur Auswahl des Kalibrierungstyps wird geöffnet. Wählen Sie Automatische Kalibrierung und drücken Sie Weiter.
   8. Wenn das Fenster "Vorkalibrierungseinstellung" geöffnet wird, befolgen Sie die Anweisungen der Software und drücken Sie die Schaltfläche "Weiter".
   9. Wenn das Fenster "Mapping-Informationen" geöffnet wird, speichern Sie diese Kalibrierung entsprechend im gewünschten Ordner. Dies geschieht durch Eingabe des Datums, des Mikroskopnamens, des Objektivs und des Filters.
   10. Klicken Sie nach der Kalibrierung auf die Schaltfläche Definition des Arbeitsbereichs unter der Registerkarte mit dem Produktnamen des Werkzeugs für gemusterte Beleuchtung, um bei Bedarf den Arbeitsbereich des Werkzeugs für gemusterte Beleuchtung zu definieren.
6. Sequenzdesign-Sektion für die Modellvorbereitung.
   1. Drücken Sie die Schaltfläche Sequenzentwurf in der linken Seitenleiste des Softwarefensters. Drücken Sie dann die Schaltfläche Profilsequenz-Editor.
   2. Wenn das Fenster Profilsequenz-Editor geöffnet wird, wählen Sie die Option Neues Profil in der Profilliste aus.
      HINWEIS: Nun wird ein Mustereditor-Fenster geöffnet.
   3. Bereiten Sie das gewünschte Muster für die Belichtung vor, indem Sie verschiedene Musterformen und -größen auswählen oder das Muster bei Bedarf manuell zeichnen.
   4. Für Kreis- und gebrochene Kreuzmuster für das Bulk-Hydrogel befolgen Sie die Schritte 8.6.5 bis 8.6.6
   5. Definieren Sie für Kreismuster einen Kreis mit einem Durchmesser von 30 μm über einer Zielbakterienkolonie, um die gesamte Kolonie abzudecken. Wählen Sie die Formfüllfarbe weiß.
   6. Wählen Sie für unterbrochene Kreuzmuster die Rechteckform aus dem Musterzeichnungsfenster mit den Maßen 3 μm x 8 μm. Platzieren Sie vier Rechtecke mit diesen Abmessungen an den Rändern der Zielkolonie, während die Hälfte der Muster eine Überlagerung mit der Kolonie hat.
   7. Für Kreis- und Ringmuster für die Mikrotiter-Arrays führen Sie die Schritte 8.6.8 bis 8.6.10 aus.
   8. Zeichnen Sie für Kreismuster einen Kreis mit einem Durchmesser von 10 μm um den Umfang der Vertiefung. Wählen Sie die Formfüllfarbe weiß.
   9. Für das Ringmuster zeichnen Sie einen Kreis mit einem Durchmesser von 20 μm, legen ihn über die Vertiefung und wählen die Form Füllfarbe weiß.
   10. Zeichnen Sie ein weiteres Kreismuster mit einem Durchmesser von 10 μm mit der Füllformfarbe schwarz und platzieren Sie es um den Umfang der Vertiefung.
7. Bearbeiten Sie das Muster und ändern Sie die Formen basierend auf der gewünschten Extraktionsmethode. Stellen Sie sicher, dass das gewünschte Muster im Arbeitsbereich des Werkzeugs für die gemusterte Beleuchtung vorhanden ist.
8. Legen Sie die Probe in einen PDMS-Halter und pipettieren Sie das definierte Medium auf die Probe, um eine Austrocknung der Probe zu verhindern und eine Trägerlösung für freigesetzte Zellen bereitzustellen.
9. Ersetzen Sie diesen dann durch den Kalibrierspiegel.
10. Passen Sie den Mikroskopfokus an, um ein scharfes Bild der Kolonien im Hydrogel zu erhalten. Inspiziere die Kolonien, um eine interessante Kolonie zu identifizieren.
11. Entwerfen Sie hier die Lichtmuster, während die Kameraansicht die Kolonien im Inneren der Probe zeigt, um verschiedene Muster für die Zellextraktion zu testen.
12. Speichern Sie das definierte Muster. Nachdem Sie das definierte Muster gespeichert haben, wählen Sie den Abschnitt Sitzungssteuerung aus.
13. Fügen Sie in diesem Abschnitt auf der Registerkarte mit dem Produktnamen des gemusterten Beleuchtungswerkzeugs die gespeicherte Sequenz hinzu.
14. Nachdem Sie die Sequenz hinzugefügt haben, wählen Sie die Option aus, um das Muster zu simulieren, um es anzuzeigen und an den gewünschten Belichtungsort anzupassen.
    HINWEIS: Hier kann die Position des Musters angepasst werden, um sicherzustellen, dass das Muster genau in den Zielbereich projiziert wird.
15. Stellen Sie anschließend unter dem Reiter LED-Steuerung die Lichtintensität auf 60 % und die Belichtungszeit auf 40 s ein und starten Sie den Belichtungsvorgang.
16. Überwachen Sie den Hydrogelabbau in Echtzeit und im Hellfeldmodus, um die Zellfreisetzung sicherzustellen.
    HINWEIS: Vermeiden Sie Bewegungen der Probe während der Lichteinwirkung, da dies zu einer Verschlechterung unerwünschter Bereiche des Hydrogels führen kann, was zu einer Kreuzkontamination führt.

9. Entnahme von Zellen

1. Nach einer Lichtexposition von 365 nm und der Zellfreisetzung werden die Zellen mit einer Mikroliterspritze und einem mikrofluidischen Schlauch entnommen (Abbildung 2).
   HINWEIS: Die Zellentnahme muss unmittelbar nach der Musterbelichtung erfolgen. Dies ermöglicht eine lokalisierte Zellrückgewinnung, bevor sich die freigesetzten Zellen aus dem bestrahlten Bereich entfernen.
2. Ändern Sie das Mikroskop von Hellfeld auf FITC- oder TRITC-Filter, um den belichteten Bereich der Probe mit bloßem Auge sichtbar zu machen.
3. Sobald sich der freiliegende Bereich befindet, legen Sie das Ende des Schlauchs auf die bestrahlte Stelle. Schalten Sie dann den Mikroskopfilter wieder auf Hellfeld um, um die Zellentnahme in Echtzeit zu überwachen.
4. Verwenden Sie die Spritze, die am anderen Ende des Schlauchs befestigt ist, um die freigesetzten Zellen vorsichtig zu entnehmen. Entnehmen Sie 200 μl der Lösung und geben Sie die Lösung in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen zur DNA-Analyse oder Beschichtung.

Results

Abbildung 1: Hydrogelbildung auf Deckgläsern aus thioliertem Glas. (A) Abstandhalter mit einer Dicke von 12,7 μm werden auf zwei gegenüberliegenden Seiten eines Basisdeckglases platziert, das reaktive Thiolgruppen enthält. (B) Die Hydrogel-V...

Materials