Quantifizierung von bakteriellem Alginat mit dem Uronsäure-Carbazol-Assay

Zusammenfassung

Quelle: Al Ahmar, R., et al. Kultur einer kleinen Kolonievariante von Pseudomonas aeruginosa und Quantifizierung ihres Alginats. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt einen kolorimetrischen Assay zur Quantifizierung von Alginat, das von Pseudomonas aeruginosa produziert wird, wobei Carbazol zum Nachweis von Uronsäuren nach saurer Hydrolyse verwendet wird. Die Methode ermöglicht eine vergleichende Analyse der Alginatproduktion, normiert auf bakterielle Biomasse in Forschung und klinischen Studien.

Protokoll

1. Uronsäure-Carbazol-Assay

1. Identifizieren Sie eine einzelne Kolonie aus einer Reinkultur des gewünschten Stammes, der getestet werden soll. Entnehmen Sie mit einem sterilen Zahnstocher die Kolonie und legen Sie den Zahnstocher in ein Kulturreagenzglas mit 5 ml Pseudomonas-Isolationsbouillon (PIB). Grow in einem Shaker-Inkubator bei 37 °C für 24 h.
   ANMERKUNG: Die folgenden Stämme, PAO581 (PAO1mucA25), PAO581carA, PAO581carB und PAO581pyrD, wurden auf PIA-Platten (Pseudomonas-Isolations-Agar ) oder PIA-Platten gezüchtet, die mit 0,1 mM Uracil ergänzt wurden, um Alginat für die Messung zu gewinnen.
2. Auf einer vorgewärmten PIA-Platte 150 μl kultivierte PIB-Bouillon (für 15 mm x 100 mm Platten) oder 450 μl Bouillon (für 15 mm x 150 mm Platten) geben. Mit einem sterilen Zellspreizer die Brühe auf dem Teller verteilen. Lass die Platte 24 Stunden lang bei 37 °C wachsen.
   ANMERKUNG: Saugen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einer Pipette aus der Platte ab, indem Sie die Platte zur Seite kippen. Sowohl die PIB- als auch die PIA-Platte, die im Protokoll verwendet wird, enthalten 20 ml/l Glycerin, das die Zellen als Kohlenstoffquelle verwenden, um die Alginatproduktion zu unterstützen.
3. Geben Sie mit einer Pipettierhilfe und einer sterilen 50-ml-Pipette 0,85 % NaCl (Natriumchlorid) auf den angebauten Rasen und entnehmen Sie die Probe, indem Sie die Platte mit einem Zellstreuer abkratzen. Aspirieren Sie die Probe mit einer frischen 50-ml-Pipette in ein 50-ml-Sammelröhrchen. Wirbeln Sie die Probe auf hoher Stufe, um sie zu mischen und auf Eis zu legen.
   ANMERKUNG: Das Volumen der zugesetzten 0,85 % NaCl variiert je nach Größe der Platte. Verwenden Sie für Platten mit einer Größe von 15 mm x 100 mm 10-30 mL und für Platten mit 15 mm x 150 mm 20-50 mL.
4. Messen Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) der Proben, indem Sie 1 ml der Probe in eine Einwegküvette geben und den OD mit einem Spektralphotometer ablesen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um ein Dreifaches an Messwerten für jede Probe zu erhalten.
5. Geben Sie 3 ml der Schwefelsäure/Borat-Lösung in Kulturröhrchen und lassen Sie sie auf Eis ziehen. 350 μl der gesammelten Probe langsam in die Säuremischung in den Reagenzgläsern geben und kurz auf niedriger Stufe einkreisen.
   1. Bereiten Sie Boratfond vor, indem Sie 10,099 g Kaliumhydroxid (KOH)-Pulver zu 45 ml Wasser hinzufügen. Geben Sie 24,74 g Borsäure (H₃BO₃) in die Mischung und bringen Sie das Volumen auf 100 mL.
   2. Stellen Sie eine 1-Liter-Flasche in ein Waschbecken mit Eis und füllen Sie sie mit 500 mL konzentrierter Schwefelsäure. Fügen Sie LANGSAM 15 ml des vorbereiteten Boratmaterials hinzu. Lassen Sie die Flasche abkühlen.
   3. Fügen Sie weitere 10 ml Boratbestand hinzu, so dass es insgesamt 25 ml ergibt. Sobald die Flasche abgekühlt ist, bringen Sie das Volumen auf 1 l.
      VORSICHT: Dieses Verfahren beruht auf der Verwendung von hochkonzentrierter Schwefelsäure. Zur Gewährleistung der Sicherheit sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung verwendet werden, und das ordnungsgemäße Entsorgungsprotokoll für die Probe sollte befolgt werden.
      ANMERKUNG: Für eine Positivkontrolle wird eine bekannte Konzentration von D-Mannuronsäure und/oder eine bekannte bakterielle Alginatprobe entnommen und durch Alginat-produzierende Stämme von P. aeruginosa (z. B. PAO581-PAO1mucA25) gereinigt. Für eine Negativkontrolle verwenden Sie eine 0,85%ige NaCl-Lösung und/oder PAO1ΔalgD (In-Frame-Deletion des algD-Gens, die die Bakterien völlig unfähig macht, Alginat zu produzieren). Aus jeder Probe können mehrere Röhrchen hergestellt werden, um die Anzahl der technischen Wiederholungen zu erhöhen und die statistische Analyse zu unterstützen. Bereiten Sie 3-5 Röhrchen jeder Probe vor.
6. 100 μl 0,1 % Carbazol in Ethanollösung zur Säure-Proben-Mischung hinzufügen. Verschließen Sie die Röhre und den Wirbel auf mittlerer Stufe für 5 s. 30 min in ein trockenes Bad bei 55 °C stellen.
7. Nach der Inkubation die Röhrchen entfernen und kurz auf hoher Stufe vortexen und 5 min abkühlen lassen.
   ANMERKUNG: Die Farbe, die zu sehen wäre, wäre ein Lilaton. Die Farbe bleibt für die Messung 1-2 h stabil.
8. Lesen Sie den Außendurchmesser₅₃₀ jedes Röhrchens ab, indem Sie 1 ml der Mischung in eine saubere Küvette geben und den Außendurchmesser der Proben bei 530 nm auf einem Spektralphotometer ablesen. Verwenden Sie das Röhrchen mit 0,85 % NaCl als Rohling im Spektralphotometer.
9. Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie den OD₅₃₀ der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von D-Mannuronsäure (1.024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml und 8 μg/ml) messen. 2x wiederholen. Extrahieren Sie eine lineare Gleichung aus diesen Messwerten.
   ANMERKUNG: Die Standardkurve muss nur einmal gemacht werden. Die daraus extrahierte lineare Gleichung kann für spätere Tests verwendet werden.
   1. Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe unter Verwendung der Standardkurve und dividieren Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD₆₀₀ , um die Gesamtmenge an Alginat pro OD₆₀₀ zu erhalten.

Materialien