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1. ELISA für die Alginat-Quantifizierung
1. Geben Sie mit einer Mikropipette 50 μl der entnommenen Probe auf eine unbehandelte 96-Well-Platte. Geben Sie 50 μl Beschichtungspuffer (Karbonat-/Bikarbonatpuffer pH 9,6) in die Vertiefungen. Die Platte bei 37 °C 2 h inkubieren.
ANMERKUNG: Für eine Positivkontrolle kann eine bekannte Konzentration von D-Mannuronsäure und/oder ein bekannter stabiler Alginat-produzierender Stamm (z.B. PAO581-PAO1mucA25) verwendet werden. Für eine Negativkontrolle verwenden Sie eine 0,85%ige NaCl-Lösung und/oder PAO1ΔalgD (die In-Frame-Deletion des algD-Gens macht die Bakterien völlig unfähig, Alginat zu produzieren). Aus jeder Probe können mehrere Wells hergestellt werden, um die Anzahl der technischen Wiederholungen zu erhöhen und die statistische Analyse zu unterstützen. Bereiten Sie 3-5 Vertiefungen jeder Probe vor.
2. Waschen Sie die Plattenvertiefungen mit einer Spritzflasche 2x mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,05 % Tween 20 (PBS-T), indem Sie die Vertiefungen füllen und dann durch Umdrehen der Platte entleeren.
3. Geben Sie mit einer Mikropipette 200 μl Blockierungspuffer (10 % Magermilch in PBS-T) in die Vertiefungen. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
ANMERKUNG: Wickeln Sie die Platte in Paraffinfolie oder Schrumpffolie ein, um eine Verdunstung im Kühlschrank zu vermeiden.
4. Waschen Sie die Vertiefungen der Platte mit einer Spritzflasche 2x mit PBS-T, indem Sie die Vertiefungen füllen und dann durch Umdrehen der Platte entleeren.
5. Mit einer Mikropipette 100 μl verdünnten Primärantikörper (monoklonaler Anti-Alginat-Antikörper der Maus) in die Vertiefungen geben und 1-2 h bei 37 °C inkubieren.
ANMERKUNG: Der Primärantikörper (monoklonaler Anti-Alginat-Antikörper der Maus) wurde in einer Konzentration von 0,5 μg/ml (Verdünnung von 1:2.000 von 1 mg/ml Stamm) in Antikörperverdünnungslösung (1 % Magermilch in 1x PBS) bereitgestellt.
6. Waschen Sie die Vertiefungen der Platte mit einer Spritzflasche 3x mit PBS-T, indem Sie die Vertiefungen füllen und dann durch Umdrehen der Platte entleeren.
7. Mit einer Mikropipette 100 μl verdünnten Sekundärantikörper in die Vertiefungen geben und 1-2 Stunden bei 37 °C inkubieren.
ANMERKUNG: Als Sekundärantikörper wurde ein Pierce Goat-Anti-Maus-Antikörper gegen Polymeerrettichperoxidase (HRP) in einer Konzentration von 0,25 μg/ml (Verdünnung von 1:2.000 von 0,5 mg/ml) in Antikörperverdünnungslösung verwendet.
8. Waschen Sie die Plattenvertiefungen mit einer Spritzflasche 3x mit PBS-T, indem Sie die Vertiefungen füllen und dann durch Umdrehen der Platte entleeren.
9. Mit einer Mikropipette 100 μl TMB-Lösung (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin)-ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) (Materialtabelle) zugeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
ANMERKUNG: Die Farbe einer positiven Reaktion wäre ein Blauton.
10. Mit einer Mikropipette 100 μl Stopplösung (2 N Schwefelsäure) zugeben.
ANMERKUNG: Die Farbe wechselt von blau zu gelb, wenn die Stopplösung hinzugefügt wird. Die Farbe ist bis zu 30 Minuten nach Beendigung der Reaktion stabil.
11. Lesen Sie mit einem Plattenlesegerät den Außendurchmesser bei 450 nm ab.
12. Erstellen Sie eine Standardkurve, indem Sie den OD450 der seriellen Verdünnungen bekannter Konzentrationen von D-Mannuronsäure (1.024 μg/ml, 512 μg/ml, 256 μg/ml, 128 μg/ml, 64 μg/ml, 32 μg/ml, 16 μg/ml und 8 μg/ml) messen. 2x wiederholen. Extrahieren Sie aus diesen Messwerten eine lineare Gleichung.
ANMERKUNG: Die Standardkurve muss nur einmal erstellt werden. Die daraus extrahierte lineare Gleichung kann für spätere Tests verwendet werden.
1. Berechnen Sie die Konzentration des Alginats in jeder Probe anhand der Standardkurve und dividieren Sie die Alginatkonzentration aus der linearen Gleichung durch OD600 , um die Gesamtmenge an Alginat pro OD600 zu erhalten.