Modellierung der vaginalen Besiedlung von Mäusen durch anaerobe Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Morrill, S. R., et al. Modelle der vaginalen Besiedlung von Mäusen durch anaerob gewachsene Bakterien. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt ein Protokoll zur Modellierung der vaginalen Besiedlung bei Mäusen mit antibiotikaresistenten anaeroben Bakterien. Sie beginnt mit einer Hormonbehandlung, um die epitheliale Anfälligkeit zu erhöhen, gefolgt von der vaginalen Inokulation und der Co-Inokulation unter anaeroben Bedingungen. Das Verfahren schließt mit einer Probenahme nach der Inokulation und einer Kultur ab, um die bakterielle Besiedlung und die Biofilmbildung zu bewerten.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Vorbereitung des Inokulums

ANMERKUNG: Dieser Abschnitt enthält die allgemeinen Schritte zur Herstellung von Inokula aus anaerob gezüchteter Streptomycin-resistenter Gardnerella vaginalis JCP8151B-SmR. Alle Schritte in diesem Abschnitt sollten in einer anaeroben Kammer durchgeführt werden.

1. Alle Reagenzien, einschließlich zubereiteter New York City Bouillon III (NYCIII), Agar und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), werden vor der Verwendung mindestens 24 Stunden lang in eine anaerobe Kammer gegeben.
   ANMERKUNG: Hier wurde eine anaerobe Vinylkammer verwendet, die mit einem 5%igen Wasserstoffgasgemisch äquilibriert wurde. Die interne Sauerstoffkonzentration liegt in der Regel bei 0 ppm, obwohl es beim Einleiten von Materialien in die Kammer zu geringfügigen vorübergehenden Erhöhungen (10-25 ppm) kommen kann.
2. Zwei Tage vor der vaginalen Inokulation streichen Sie Gardnerella aus einem gefrorenen Glycerinvorrat auf eine NYC III-Agarplatte in der anaeroben Kammer. Verwenden Sie einen kleinen Behälter (z. B. eine leere Pipettenspitzenbox), der mit Trockeneis gefüllt ist, um den Glycerinvorrat während des Transports in und aus der Kammer gefroren zu halten.
3. 1 Tag vor der vaginalen Inokulation verwenden Sie 5-10 einzelne Gardnerella-Kolonien von der Platte, um 10 ml NYC III-Brühe zu impfen. Lassen Sie die Flüssigkultur über Nacht 16 Stunden lang bei 37 °C wachsen. Geben Sie ein zweites 1-ml-Aliquot des Kulturmediums, das nicht beimpft ist, und inkubieren Sie es neben der inokulierten Kultur, um zu bestätigen, dass das Medium nicht kontaminiert ist.
4. Bereiten Sie das Inokulum aus Flüssigkultur wie unten beschrieben vor. Führen Sie die Inokulumvorbereitung so weit wie möglich in der anaeroben Kammer durch.
   1. Bestimmen Sie die optische Dichte (OD) der Kultur, indem Sie 200 μl Kultur zu 800 μl frischem Medium in einer 1,5-ml-Küvette (1:5-Verdünnung) hinzufügen. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Dichte (OD) der verdünnten Kultur bei einer Wellenlänge von 600 nm zu messen (verwenden Sie eine separate Küvette mit nur frischem Medium als Rohling). Multiplizieren Sie den OD-Messwert mit 5, um den tatsächlichen OD₆₀₀ der 16-Stunden-Kultur zu erhalten.
   2. Berechnen Sie das Volumen des Inokulums, das für das Experiment benötigt wird. Um beispielsweise 15 Mäuse mit einem Inokulum von 20 μL pro Maus zu infizieren, werden 15 x 20 μL = 300 μL Inokulum benötigt. Bereiten Sie etwa 25 % mehr Inokulum vor als benötigt, also für 15 Mäuse 300 μl + (0,25 x 300 μl) = 375 μl Inokulum.
   3. Berechnen Sie unter Verwendung des in Schritt 1.4.1 ermittelten OD₆₀₀ das Volumen der 16-h-Kultur, das heruntergeschleudert und resuspendiert werden muss, um ein OD₆₀₀ = 5,0 Inokulum in dem in Schritt 1.4.2 berechneten Volumen zu erhalten. Wenn beispielsweise der OD₆₀₀ der Kultur 1,5 beträgt und das benötigte Inokulumvolumen 375 μl beträgt, beträgt das Volumen der zu schleudernden Kultur (375 μl x 5)/1,5 = 1250 μl.
   4. Pipettieren Sie das in Schritt 1.4.3 berechnete Kulturvolumen. in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen. Pelletieren Sie die Bakterien, indem Sie bei 16.000 x g für 1-3 min zentrifugieren.
   5. Den Überstand entfernen und das Pellet in anaerobem PBS bei dem in Schritt 1.4.2 berechneten Volumen resuspendieren. Das Inokulum liegt nun bei einem berechneten OD₆₀₀ von 5,0. Bereiten Sie gegebenenfalls auch ein Röhrchen PBS vor, das als Vehikelkontrolle für Mäuse in der nicht infizierten Kontrollgruppe dient.
5. Bevor Sie das Inokulumröhrchen aus der anaeroben Kammer nehmen, bereiten Sie eine serielle Verdünnungsreihe von 1:10 bis 1:10 x 10⁶ in PBS vor. Die Spotplatte 5 repliziert jede Verdünnung auf eine Agarplatte unter Verwendung einer Mehrkanalpipette, um die koloniebildenden Einheiten oder KBE des Inokulums zu bestimmen. Dies ist die KBE vor der Inokulation.
6. Vaginale Vorspülung und Inokulation mit Gardnerella
   1. Bereiten Sie die Vaginalspülung/Waschschläuche in der anaeroben Kammer vor. Pipettieren Sie 70 μl steriles, anaerobes PBS in 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, die mit Mausnummern markiert sind. Bereiten Sie ein Waschrohr pro Maus vor. Verschließen Sie die Schläuche fest und führen Sie sie aus der anaeroben Kammer heraus.
   2. Bei jeder Maus wird eine Vaginalspülung mit 50 μl anaerobem PBS aus den einzelnen Röhrchen durchgeführt, die in Schritt 2.1 vorbereitet wurden. Diese Vaginalspülungen sind die Waschmittel vor der Inokulation und können für nachgelagerte Messungen und Assays verwendet werden.
      1. Nach der Verabreichung der zweiten β-Estradiolvalerat-Injektion legen Sie jede Maus auf einen Käfig oder eine saubere, harte Oberfläche, die sie mit den Vorderpfoten greifen kann. Fassen Sie vorsichtig den mittleren Teil des Schwanzes und heben Sie ihn an, so dass die Hinterhand leicht angehoben ist und die Vaginalöffnung freiliegt.
      2. Entnehmen Sie mit einer Pipette und der Filterspitze p-200 50 μl PBS aus dem Waschröhrchen, das der entsprechenden Maus entspricht. Führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig in das Vaginallumen ~2-3 mm ein und pipettieren Sie das Volumen von 50 μl vorsichtig 3x-4x ein und aus.
      3. Übertragen Sie das gesammelte Waschmaterial (~50 μl) zurück in dasselbe Waschröhrchen, aus dem es stammt, und pipettieren Sie es in dem Waschröhrchen, das noch die restlichen 20 μl PBS enthält, auf und ab. Wenn übermäßiger Schleim vorhanden ist und die Spitze verstopft ist, verwenden Sie eine saubere p200-Spitze, um das restliche Material aufzufangen, und legen Sie es in dasselbe Waschrohr.
   3. Verabreichen Sie vaginal 20 μl der konzentrierten Bakteriensuspension oder Vehikelkontrolle in die Vagina jeder Maus. Impfen Sie jede Maus unmittelbar nach der Vaginalspülung für diese Maus (d. h. führen Sie die Spülung und Inokulation nacheinander für jede Maus durch, bevor Sie zur nächsten übergehen). Um diesen Vorgang zu vereinfachen, verwenden Sie zwei p200-Pipetten – eine auf 50 μl für Spülungen und die andere auf 20 μl für Impfungen.
      1. Positionieren Sie die Maus wie in Schritt 2.2.1 beschrieben. Pipettieren Sie mit einer p-200-Spitze 20 μl Bakteriensuspension in die Vagina. Für Co-Inokulationsexperimente mit zwei verschiedenen Bakterienarten/-stämmen verwenden Sie 10 μl jeder Bakteriensuspension und vermeiden Sie es, die beiden Stämme vor der Inokulation zu mischen.
         ANMERKUNG: Das Gesamtimpfvolumen sollte 20 μl nicht überschreiten, um ein Übergreifen aus der Vagina zu vermeiden.
      2. Halten Sie das hintere Ende jeder Maus 10-20 s lang hoch, um zu verhindern, dass sich das verabreichte Volumen sofort am vaginalen Introitus sammelt. Setzen Sie die Maus dann in einen neuen Käfig/Behälter oder zu Käfiggenossen, die bereits geimpft wurden.
      3. Wiederholen Sie Schritt 2.2. und Schritt 2.3. für jede Maus. Setzen Sie Mäuse niemals wieder in einen Käfig mit Tieren, die noch nicht geimpft wurden. Dies verhindert eine versehentliche Exposition von Mäusen gegenüber Streptomycin-resistenten Bakterien vor der Inokulation.
   4. Nachdem alle Mäuse geimpft wurden, führen Sie das Inokulum zurück in die anaerobe Kammer. Bereiten Sie eine weitere serielle Verdünnung vor und plattieren Sie sie, wie in Schritt 1.5 beschrieben. Dies ist die KBE nach der Inokulation. Vergleichen Sie die KBE aus den Platten nach der Inokulation und vor der Inokulation, um festzustellen, ob die Lebensfähigkeit des Inokulums abnahm, während es sich während der Inokulation der Tiere außerhalb der anaeroben Kammer befand.
   5. Plattieren Sie die in Schritt 2.2 gesammelten Vaginalspülungen. auf selektiven Agar (in diesem Fall 1 mg/ml Streptomycin). Inkubieren Sie die Platten 1-2 Tage lang in einer anaeroben Kammer bei 37 °C und untersuchen Sie sie auf Wachstum. HINWEIS: Das Wachstum deutet darauf hin, dass endogene Mitglieder des Mikrobioms resistent gegen den Selektionsmarker sind und daher die KBE-Zählung des Zielorganismus verschleiern können.
7. Entnahme von Vaginalspülungen zur Bestimmung einer lebensfähigen Gardnerella-Besiedlung
   1. Sammeln Sie die Vaginalwaschungen zu ausgewählten Zeitpunkten, um die vaginale Besiedlung zu analysieren. Sammeln Sie wie in Schritt 2.2 beschrieben.
   2. Unmittelbar nach der Entnahme die Vaginalspülungen in eine anaerobe Kammer einleiten. Verwenden Sie 10 μl jeder Spülung, um eine serielle Verdünnung und Beschichtung auf selektiven Agar durchzuführen, wie in Schritt 1.5 beschrieben. Verwenden Sie die KBE-Zählungen als Maß für die vaginale Besiedlung durch Gardnerella (oder eine andere anaerobe von Interesse).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
β-Östradiol 17-valerat	Sigma	Nr. E1631	Östrogenisierung von Mäusen
1x PBS	Fischer	MT21040CM	Vaginalspülung, Inokulumvorbereitung von G. vaginlalis , Gewebeentnahme und Homogenisierung
Anaerobe Kammer	Schüchtern	7200000	Wachstum von anaeroben Bakterien
Bacto Agar	Fischer	DF0140074	G. vaginalis-, F. nucleatum- und P. bivia-Agarplatten
Traubenzucker	Sigma	Nr. G7528	NYCIII media für das Wachstum von G. vaginalis
HEPES	Cellgro	Artikel-Nr.: 25-060-Cl	NYCIII media für das Wachstum von G. vaginalis
Pferde-Serum	Gefäßklemme	SHS500	NYCIII media für das Wachstum von G. vaginalis
Wasserstoff-Gasgemisch (5 % Wasserstoff, 10 % CO₂, 85 % Stickstoff)	Matheson		Gas für die anaerobe Kammer
Milli-Q Wasseraufbereiter	Millipore	IQ-7000	zur Herstellung von Medien und zur Homogenisierung
NaCl	Sigma	Nr. S3014	NYCIII media für das Wachstum von G. vaginalis
Stickstoffgas	Airgas		Gas für die anaerobe Kammer
P-200 Filterspitzen	ISC Biografie	Nr. P-1237-200	Vaginalspülungen und bakterielle Impfungen
Sesamöl	Fischer	ICN15662191	Östrogenisierung von Mäusen
Spektralphotometer	BioChrom	80-3000-45	Messung von bakteriellem OD₆₀₀
Streptomycin	Gibco	11860038	Zu Agar-Medien hinzufügen, um selektive Platten herzustellen
Hefeextrakt	Fischer	DF0127-17-9	NYCIII media für das Wachstum von G. vaginalis