Sämlingsflut-Assay zum Screening der bakteriellen Resistenz bei Tomaten

Zusammenfassung

Quelle: Hassan, J. A., et al. Hochdurchsatz-Identifizierung von Resistenzen gegen Pseudomonas syringae pv. Tomate in Tomate mit dem Seedling Flood Assay. J. Vis. Exp. (2020).

Dieses Video zeigt eine Methode zum Screening auf bakterielle Resistenz bei verschiedenen Tomatenstämmen mit zehn Tage alten Sämlingen, die mit einer bakteriellen Suspension geimpft wurden. Es wird erklärt, wie Bakterien durch Spaltöffnungen eindringen, Effektorproteine liefern, um die pflanzliche Immunität zu unterdrücken, und wie sich die Reaktionen von Pflanzen zwischen anfälligen und resistenten Stämmen unterscheiden. Das Ergebnis wird durch die Beobachtung sichtbarer Wachstumsunterschiede bewertet, wobei resistente Pflanzen gesund bleiben und anfällige Pflanzen Gewebeschäden aufweisen.

Protokoll

1. Methode zur Flutung von Tomatensämlingen

1. Nehmen Sie die Platten mit den 10 Tage alten Sämlingen aus der Wachstumskammer und legen Sie sie in die Biosicherheitswerkbank, um die Platten für die Überflutung vorzubereiten.
2. Entfernen Sie das chirurgische Klebeband von zwei Platten.
3. Stellen Sie einen Timer auf 3 Minuten. Messen Sie 6 mL des endgültigen Inokulums von P. syringae pv. Tomate (Pst) (Pst19 OD₆₀₀ = 0,0075 oder PstDC3000 OD₆₀₀ = 0,005) und geben Sie 6 ml Inokulum auf jede Platte mit den 10 Tage alten Sämlingen.
4. Schieben Sie die Sämlinge vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze in das Inokulum. Starten Sie den Timer.
5. Halten Sie einen Teller in jeder Hand. Kippen Sie die Vorderseite der Platte nach unten, um das Inokulum anzusammeln und hauptsächlich die Keimblätter und Blätter der Sämlinge einzutauchen.
6. Schwenken Sie 5–7x von einer Seite zur anderen und kippen Sie dann die Platten zurück, um die Wurzeln und die gesamte Platte zu bedecken.
7. Kippen Sie die Platten wieder nach unten, um die Keimblätter und Blätter einzutauchen, und wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt 3 Minuten.
8. Gießen Sie das Inokulum von den Platten, legen Sie die Platten auf eine ebene Fläche und gießen Sie dann das restliche Inokulum ein zweites Mal ab.
9. Wickeln Sie die Platten wieder mit chirurgischem Klebeband ein und wiederholen Sie die Schritte 1.2–1.8 für alle verbleibenden Platten.
10. Inkubieren Sie die Platten in der Wachstumskammer erneut, nachdem alle Platten geflutet wurden.

Phänotyp nach 7–10 Tagen für PstDC3000 oder 10–14 Tagen für Pst19.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biosicherheitswerkbank Klasse II Typ A2
BRAND Einweg-Kunststoffküvetten, Polystyrol	VWR Deutschland	47744-642
Chenille Kraft Zahnstocher aus flachem Holz	VWR Deutschland	500029-808
Glas Alkohol Brenner Docht	Fisher Scientific	S41898A / Nr. W-125
Glas-Spiritus-Brenner	Fisher Scientific	S41898 / Nr. BO125
Glycerin ACS Reagenz	VWR Deutschland	EMGX0185-5
Kimberly-Clark™ Kimtech Science™ Kimwipes™ Empfindliche Arbeitswischer	Fisher Scientific	06-666-A
Magnesiumchlorid, ACS-Qualität	VWR Deutschland	97061-356
Magnesiumsulfat-Heptahydrat, ACS-Qualität	VWR Deutschland	97062-130
Mikrozentrifugenröhrchen, 1,5 mL
Mikrozentrifugenröhrchen, 2,2 mL
Murashige & Skoog, Basalsalze	Caisson Laboratories, Inc.	MSP01-50LT
Pipet-Lite XLS LTS 8-Kanal Pipette 20-200uL	Rainin	L8-200XLS
Pipet-Lite XLS LTS 8-Kanal Pipette 2-20uL	Rainin	L8-20XLS
Polystyrol 100mm x 25mm sterile Petrischale	VWR Deutschland	89107-632
Polystyrol 150mm x 15mm sterile Petrischale	Fisher Scientific	Artikel-Nr.: FB08-757-14
Polystyrol 150x15mm sterile Petrischale	Fisher Scientific	08-757-148
Spitzen LTS 20 μL 960/10 GPS-L10	Rainin	17005091
Spitzen LTS 250 μL 960/10 GPS-L250	Rainin	17005093