Lokalisierte Abgabe von Bakterien in das Darmlumen einer Zebrafischlarve mittels Mikroinjektion

Zusammenfassung

Quelle: Li, J. et al. Entwicklung eines Zebrafisch-Infektionsmodells für Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Mikroinjektion von fluoreszenzmarkierten Clostridioides difficile in das Darmlumen einer anästhesierten Zebrafischlarve. Es beschreibt die Schritte der Larvenvorbereitung, der bakteriellen Injektion und der fluoreszenzmikroskopischen Bestätigung der bakteriellen Lokalisierung im Darm.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Injektion von gefärbten Clostridioides difficile in Zebrafischlarven

1. Narkose 20–30 Zebrafischlarven 5 Tage nach der Befruchtung (hier als 5 dpf bezeichnet) mit 0,02%–0,04% Tricain (Tricainpulver wird in doppelt destilliertem Wasser aufgelöst und mit 1 M Tris-HCL-Lösung auf pH = 7 eingestellt) in 30% Danieau's Medium ~10 min vor der Injektion. Übertragen Sie die betäubten Larven in eine frische 10 cm Petrischale und entfernen Sie überschüssige 30% Danieau-Medium.
2. Geben Sie einen Tropfen 0,8 % niedrigschmelzende Agarose auf die Zebrafischlarven, um sie zu bedecken. Stellen Sie die Larven vorsichtig in eine seitliche Position. Stellen Sie die Petrischale für 30–60 s auf Eis, damit sich die niedrigschmelzende Agarose verfestigen kann. Fügen Sie 30 % Danieau-Medium mit 0,02 % bis 0,04 % Tricain hinzu, um die Agarose zu bedecken.
3. Bereiten Sie die Injektionslösung vor. Geben Sie 1 μl 0,5 % Phenolrot in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in 9 μl des farbstoffgefärbten Clostridioides difficile-Inokulums , um den Injektionsprozess zu visualisieren.
4. Beladen Sie eine kalibrierte Mikroinjektionsnadel mit der Injektionslösung mit einem Mikrolader. Montieren Sie die geladene Nadel auf einen Mikromanipulator und positionieren Sie sie unter einem Stereomikroskop.
5. Stellen Sie den Einspritzdruck zwischen 600 und 900 hPa ein. Stellen Sie die Injektionszeit auf 0,1–0,3 s ein, um 0,5–1,0 nL zu erhalten. Setzen Sie die Nadel in den Mikromanipulator in einem Winkel von ~45° in Richtung der eingebetteten Larven.
6. Platzieren Sie die Nadelspitze über dem Magen-Darm-Trakt, in der Nähe der Urogenitalpore. Durchstechen Sie Agarose, dann den Muskel mit der Nadelspitze, führen Sie sie in das Darmlumen ein und injizieren Sie 0,5–1,0 nL Clostridioides difficile. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um die injizierten Larven zu überwachen, und nehmen Sie die richtig injizierten Larven für die konfokale Bildgebung auf.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose niedrigschmelzend (LM)	Pronadisa	8050	Es wird in Agaroseplatten verwendet
BacLight Roter Bakterienfleck	Thermo Fisher Scientific	Nr. B35001	Fluoreszierender Farbstoff
Kapillarglas	Harvard-Apparatur	30-0019	Injektionsnadeln
Clostridioides difficile			R20291, ein Ribotyp 027-Stamm, TcdA+/TcdB+/CDT+-Produktion
DMSO	Carl Roth GmbH	Nr. A994
FIDSCHI	Open-Source-Plattform		Bildverarbeitung
Mikro-Injektor	Eppendorf	5253000017
Leica SP8 Konfokalmikroskop	Leica
Phenolrot	Sigma-Aldrich	Nr. P0290
Tricain	Sigma-Aldrich	Nr. E10521