Isolierung und Kultivierung von Clostridioides difficile Bakterien aus dem Zebrafischdarm der Larve

Zusammenfassung

Quelle: Li, J., et. al., Entwicklung eines Larven-Zebrafisch-Infektionsmodells für Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Isolierung und Kultivierung von Clostridioides difficile Bakterien aus dem Darm von Zebrafischlarven. Der infizierte Darm wird präpariert, homogenisiert und in selektiven anaeroben Medien inkubiert, die Antibiotika enthalten. Diese Bedingungen unterdrücken konkurrierende Mikroben und fördern das Wachstum lebensfähiger Zellen.

Protokoll

Sektion des Zebrafischdarms der Larve zur Gewinnung lebensfähiger Clostridioides difficile

1. Isolieren Sie den Magen-Darm-Trakt aus Larven, um die bakterielle Belastung zu analysieren. Beginnen Sie mit der Euthanasie von Zebrafischlarven mit 0,4 % Tricain.
2. Spülen Sie den Zebrafisch kurz mit steriler 1x PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) ab und geben Sie ihn auf eine frische Agaroseplatte.
3. Zerlegung von Zebrafischen
   1. Führen Sie bei Zebrafischlarven nahe dem Kopf eine Nadel in den Rückenrumpf ein, um den Zebrafisch ruhig zu stellen. Entfernen Sie den Kopf hinter den Kiemen mit einer Lanzette.
   2. Die zweite Nadel in die Mitte des dorsalen Rumpfes einführen. Führen Sie die dritte Nadel in den Bauch des Zebrafisches ein und ziehen Sie den Darm aus der Körperhöhle.
      ANMERKUNG: Um den intakten Darm zu isolieren, ist äußerste Vorsicht geboten. Wenn dies schwierig ist, führen Sie zusätzliche Züge durch, um den Rest des Darms von den verbleibenden inneren Organen zu trennen.
   3. Verwenden Sie eine Mikroinjektionsnadel, um 10–15 Därme in ein 1,5-ml-Röhrchen zu übertragen, das 200 μl steriles 1x PBS enthält.
   4. Homogenisieren Sie den Darm mit einem Stößel, um das Gewebe aufzubrechen und Homogenate vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass der Stößel den Boden des Röhrchens erreicht, um alle Därme vollständig zu zerstören.
4. Die Homogenate werden in einem C . difficile-Aufzuchtmedium , das D-Cycloserin und Cefoxitin enthält, mit oder ohne Taurocholat (TCA, ein Keimmittel von C. difficile-Sporen ) in einer anaeroben Kammer inkubiert.
5. Die Platte wird 48 h lang bei 37 °C anaerob inkubiert.

Materialien