Wiederbelebung und Wachstum von Milchsäurebakterien

Zusammenfassung

Quelle: Ayivi, R. et al., Die Kultivierung, das Wachstum und die Lebensfähigkeit von Milchsäurebakterien: Eine Perspektive der Qualitätskontrolle. J. Vis. Exp. (2022)

Dieses Video zeigt die Methode zur Rückgewinnung von kältegestressten Milchsäurebakterien aus einem gefrorenen Glycerinbestand, zur Wiederherstellung der bakteriellen Lebensfähigkeit durch anaerobe Inkubation und zur Isolierung aktiver Kolonien für die Kulturexpansion.

Protokoll

1. Protokoll für die Aktivierung und Qualitätskontrolle von Milchsäurebakterienkulturen (LAB)

1. Nehmen Sie die vorbereitete Glycerinbrühe der LAB-Stämme (in 2-ml-Zentrifugenröhrchen) aus dem -80 °C Ultratiefkühlschrank und lassen Sie sie vor der Verwendung nicht auftauen.
2. Reinigen und desinfizieren Sie die Öffnung der Zentrifugenröhrchen mit 70% Alkohol und wirbeln Sie sie vor dem Gebrauch vorsichtig ein.
3. Pipettieren Sie etwa 250 μl (0,25 ml) der Stamm-LAB-Kultur aus den Zentrifugenröhrchen in frische 2-ml-MRS-Reagenzgläser (deMan-, Rogosa- und Sharpe-Medien).
4. Die Reagenzgläser vorsichtig vortexen, parafilmen und über Nacht bei 42 °C 12-16 h anaerob inkubieren.
5. Nehmen Sie etwa 500 μl (0,5 ml) der über Nacht gezüchteten Kulturen aus den 2-ml-MRS-Reagenzgläsern in frische 7-ml-MRS-Reagenzgläser, wirbeln Sie sie vor und inkubieren Sie sie anaerob über Nacht bei 42 °C für 12-16 Stunden.
6. Beurteilen Sie das mikrobielle Wachstum, indem Sie die optische Dichte (OD) oder das Wachstum der Kulturen bei 610 nm mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer messen und akzeptable Ergebnisse zwischen 0,7 und 0,9 aufzeichnen.
7. Die Übernachtkulturen aus den 7-ml-MRS-Röhrchen werden auf MRS- und MRCM-PYR-Agarplatten (modifiziertes verstärktes Clostridien-Mittelpyruvat) gestreift und 72 h lang bei 42 °C anaerob inkubiert.
8. Isolierte Kolonien werden von den Agarplatten entnommen, in frische 7-ml-MRS-Reagenzgläser überführt, sanft vortexiert und über Nacht bei 42 °C für 12-16 h anaerob inkubiert.
9. Lagern Sie die Agarplatten mit den isolierten Stämmen eine Woche lang bei 4 °C im Kühlschrank.
10. Messen und bestätigen Sie die OD (zwischen 0,7 und 0,9) aus den 7-ml-MRS-Reagenzgläsern der LAB-Kulturen, die aus den gestreiften Platten bei 610 nm isoliert wurden, und verwenden Sie sie als Arbeitskulturen für alle zugehörigen Experimente.
11. Um ein Verhältnis von 1:10 zu erhalten, führen Sie zehnfache Verdünnungen (serielle Verdünnungen) der gezüchteten LAB-Kulturen aus den endgültigen 7-ml-MRS-Reagenzgläsern mit 9 ml Peptonwasser (einem physiologischen Puffer) durch.
12. Nehmen Sie schließlich etwa 250 μl (0,25 mL) aus geeigneten seriellen Verdünnungen für alle Fermentationsexperimente.
13. Die Brühe, die Stämme (250 μl) aus Schritt 2.12 enthält, werden aktiviert, indem sie in frische 7 mL MRS-Bouillon überführt und 16 h lang anaerob bei 42 °C inkubiert werden.
    ANMERKUNG: Alle L. bulgaricus-Stämme wurden in der frisch zubereiteten MRS-Bouillon aktiviert und anschließend anaerob bei 42 °C für 16 h inkubiert, um eine optische Dichte (OD₆₁₀ nm) des Bakterienwachstums zwischen 0,7 und 0,9 zu erreichen. Das Bakterienwachstum wurde mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer bei 610 nm gemessen. Die pH-Werte der Übernachtkulturen lagen im Bereich von 3,5 bis 5,3, was auf die Produktion von Milchsäure, einem organischen Endprodukt der LAB-Fermentation, zurückzuführen ist. Sicherheitsmaßnahmen wie die richtige Luftzirkulation in der Biosicherheitshaube und die Vermeidung von Verbrennungen während des Einsatzes des Bunsenbrenners wurden eingehalten und eingehalten.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Anilinblau	Thermo Scientific	Nr. R21526	ca. 25 g
Rindfleisch-Extrakt	Forschungsprodukte International	50-197-7509	500 g
Hefeextrakt	Fisher Scientific	Nr. BP1422-500	500 g
Calciumchlorid-Dihydrat	Fisher Scientific	Nr. C79-500	500 g
Dextrose wasserfrei	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-Fruktose	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco Agar Pulver	Difco	Artikel-Nr.: DF0812-07-1	2 kg
TPY-Agar	Difco	211921	500 g
Eppendorf Mikrozentrifugenröhrchen (Snap-Cap Mikrozentrifuge Safe-Lock)	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
Glycerin	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
Infrarot-CO₂-Inkubator	Forma Scientific
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgarien	Nr. S9
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Bulgarien	LB6
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Labor für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie (NCATSU)	DOHLE
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus	Labor für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie (NCATSU)	E22
Lactobacillus reuteri	Biogai, Raleigh / Labor für Lebensmittelmikrobiologie und Biotechnologie (NCATSU)	RD2
L-Cysteinhydrochlorid-Monohydrat	Sigma-Aldrich	C6852-25G	ca. 25 g
Maltose-Monohydrat	Fisher Scientific	M75-100	ca. 100 g
MRS Brühe	Neogen	50-201-5691	5 kg
Pepton Nr. 3	Hach	50-199-6719	500 g
Kaliumphosphat zweibasisch (K₂HPO₄)	Forschungsprodukte International	50-712-761	500 g
Natriumacetat-Trihydrat	Fisher Scientific	Nr. S220-1	ca. 1 kg
Natriumchlorid	Fisher Scientific	Nr. BP358-1	ca. 1 kg
Natriumpyruvat	Fisher Scientific	Nr. BP356-100	ca. 100 g
Reagenzgläser mit gummierten Schraubverschlüssen	Fisher Scientific	FB70125150	25 x 150 mm
Tween 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
Ultraniedriger Gefrierschrank	So-Low
Uracil	ACROS Organics	AC157301000	ca. 100 g
UV-sichtbares Spektralphotometer	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
Hefeextrakt	Fisher Scientific	Nr. BP1422-500	500 g
Ethanol	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
Salzsäure (6N (zertifiziert), Fisher Chemical)	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL