Bakterienwachstum auf einem mikrofluidischen Chip zur Untersuchung der Resistenz von Antibiotika

Zusammenfassung

Quelle: Liu, P. C., et al. Entwicklung und Verwendung eines kostengünstigen, automatisierten Morbidostat für die adaptive Evolution von Bakterien unter Auswahl von Antibiotika. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video demonstriert die Verwendung eines mikrofluidischen Chips zur Visualisierung und zum Vergleich des Wachstums und der Morphologie von Wildtyp- und Trimethoprim-resistenten E. coli-Stämmen unter Trimethoprim-Antibiotika-Stress.

Protokoll

1. On-Chip-Wachstumsexperiment

1. Spülen Sie es vor dem Laden in das mikrofluidische Gerät 1 Stunde lang mit deionisiertem Wasser und 1 Stunde mit M9-Medium.
2. Tauen Sie die täglich gefrorene Probe 5 Minuten lang bei Raumtemperatur auf und beimpfen Sie ein neues Reagenzglas mit frischem M9-Medium. Legen Sie die Probe über Nacht bei 37 °C in einen Shaker-Inkubator.
3. Verdünnen Sie die mikrobielle Probe 10-fach mit M9-Medium und laden Sie sie in das mikrofluidische Gerät, indem Sie den mikrobiellen Probenbehälter mit 5 psi unter Druck setzen. Laden Sie dann das Trimethoprim (TMP)-Wirkstoffmedium in den Chip, indem Sie den Wirkstoffbehälter mit 5 psi unter Druck setzen. Führen Sie das Mischen zwischen der Mikrobe und dem Medikament durch, indem Sie das mikromechanische Ventil zwischen den beiden Kammern auf dem mikrofluidischen Chip 15 Minuten lang betätigen.
4. Platzieren Sie den mikrofluidischen Chip in den Mikroskop-Inkubator, der auf dem inversen Mikroskop montiert ist. Nehmen Sie das Zellbild in der Wachstumskammer 8 Stunden lang stündlich mit der CCD-Kamera auf, die am inversen Mikroskop montiert ist.
5. Verwenden Sie das benutzerdefinierte Programmskript, um die Zellennummern durch einen Schwellenwertalgorithmus für die Zellenbilddaten zu berechnen. Beachten Sie, dass die Zellzahldaten in der Regel über drei mikrofluidische Kammern gemittelt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Inverses Mikroskop	Leica Mikrosysteme	Leica DMI-LED	zur mikrofluidischen Messung Verwendung des X40-Objektivs NA=0,55
Mikroskop-Inkubator	Instrument für lebende Zellen	CU-109	Wird für die mikrofluidische Messung verwendet
Magnetventile	Pneumadyne	Artikel-Nr.: S10MM-31-12-3	Schließer offen 1,3 Watt 12 Vdc
USB-Schnittstellenkarte	Hobby Technik	USBIO24-R Digitales I/O-Modul	für mikrofluidische Messung
Luftkompressor	Rocker Scientific	WIPPE 440	Druckquelle für Mikrofluidik Max. Druck 80 Psi
Luer-Lock-Verschraubungen mit 1/8" Widerhaken	ValuePlastics.com	MTLL230-1	Wird für die mikrofluidische Steuerung verwendet
1/8" Widerhaken auf 10-32 Gewindeanschluss	ValuePlastics.com	B-1	Wird für die mikrofluidische Steuerung verwendet
Luer-Lock-Innengewinde für 10-32 Gewindeanschlüsse	ValuePlastics.com	KFTL-1	Wird für die mikrofluidische Steuerung verwendet
NPN Darlington Transistor 500mA, 40V (2N6427)	DigiKey.com	2N6427GOS-ND	Wird für die mikrofluidische Steuerung verwendet
10kOhm, Kohlefilmwiderstand, 0,25W	DigiKey.com	P10KBACT-ND	Wird für die mikrofluidische Steuerung verwendet
Tantal-Kondensator, 10uF, 25V, 10%	DigiKey.com	Nr. 478-1841-ND	Wird für die mikrofluidische Steuerung verwendet
Andor CCD-Kamera	Andor	Zyla 4.2 Plus SCMOS	Wird für die mikrofluidische On-Chip-Bildgebung verwendet
Trimethoprim	Sigma
Difco M9 minimales Salz 5x	BD		Mittel