Hochdurchsatz-Identifizierung von bakterienabweisenden Polymeren mittels Microarray-Screening

Zusammenfassung

Quelle: Venkateswaran, S., et al. Hochdurchsatz-Identifizierung von bakterienabweisenden Polymeren für Medizinprodukte. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt eine Hochdurchsatzmethode zur Identifizierung bakterienabweisender Polymere mit Hilfe eines Microarray-Objektträgers, der gemischten Bakterienkulturen ausgesetzt wurde. Die bakterielle Bindung wird durch DAPI-Fluoreszenz bewertet, wobei ein reduziertes Signal Polymere mit minimaler Oberflächenbindung anzeigt.

Protokoll

1. Beimpfung von Polymer-Microarrays mit Bakterien

ANMERKUNG: Stellen Sie eine gute aseptische Technik sicher. Die gesamte Handhabung der Kulturen sollte in einer sterilen Umgebung erfolgen: entweder mit einem Bunsenbrenner oder in einer Strömungshaube. Die Kulturen sollten mit Sauerstoffverfügbarkeit, Wachstumsmedium und Temperatur gezüchtet werden, die an die Anforderungen der jeweiligen Art angepasst sind.

1. Bereiten Sie Übernachtkulturen vor, indem Sie 5 ml Luria-Bertani-Brühe (LB: 10 g/l Bacto-Trypton, 5 g/l Natriumchlorid, NaCl und 10 g/l Hefeextrakt) mit einer Kolonie von einer Platte beimpfen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren und bei 200 U/min (Umdrehungen pro Minute) schütteln.
2. Bereiten Sie Gefrierbrühen von Übernachtkulturen durch Zugabe von Glycerin (insgesamt 10 % Konzentration) vor und lagern Sie die Brühe bei -80 °C.
3. Um die Zellzahlen aus Proben der aufgetauten Bakterienstämme zu bestimmen, führen Sie serielle Verdünnungen jedes Stammes durch und züchten Sie die Bakterien über Nacht auf festen Medien. Die genaue Bestimmung der Zellzahl in den Beständen gewährleistet eine angemessene Inokulation jeder Spezies.
4. Bereiten Sie die Inokula für den Microarray vor. Einzelartkulturen werden wie oben gezüchtet und direkt auf die Microarrays aufgebracht. BacMix-1 ist eine bakterielle Mischung aus Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) und Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 ist eine Bakterienmischung, die aus Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae und Enterococcus faecalis (E. faecalis) besteht.
5. Zur Herstellung einer der Mischkulturen über Nacht in gleichen Volumina (je 3 ml) mischen und viermal mit frischem LB (auf etwa 50 ml Endvolumen) verdünnen.
6. UV-sterilisierte Polymer-Microarrays in rechteckige 4-Well-Platten legen und mit 6 ml gemischten Bakterienkulturen bei 37 °C unter leichtem Rühren (30 U/min) 5 Tage lang inkubieren.
7. Nach der Inkubation spülen Sie die Microarrays vorsichtig zweimal vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM Kaliumchlorid, KCl, 10 mM Dinatriumhydrogenphosphat, Na₂HPO₄, 1,8 mM Kaliumdihydrogenphosphat, KH₂PO₄) und inkubieren Sie mit einer Lösung von 1 μg/ ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung in PBS für 30 min.
8. Waschen Sie die gefärbten Microarray-Objektträger in einer Frischeplatte, indem Sie sie mit PBS abdecken und vorsichtig schwenken, wobei Sie das PBS einmal wechseln. Unter Luftstrom trocknen. Tragen Sie einen gläsernen Deckglas auf den Microarray-Objektträger auf und verschließen Sie ihn mit Kleber. Nach dem Trocknen die äußere Oberfläche mit 70 % (v/v) Ethanol sterilisieren.
9. Entsorgen Sie Kulturen sicher entsprechend ihrer Eindämmungsstufe.

2. Microarray-Bildgebung und -Analyse

1. Nehmen Sie Einzelbilder für jeden Polymerfleck in Hellfeld- und DAPI-Kanälen (Anregung/Emission, Ex/Em = 358 nm / 361 nm) auf. Führen Sie dies manuell mit einem Fluoreszenzmikroskop oder mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop (mit einem X-Y-Z-Tisch, der von einer Bilderfassungssoftware gesteuert wird) durch, das mit einem 20X-Objektiv ausgestattet ist.
   ANMERKUNG: Passen Sie das Mikroskop so an, dass Bilder mit Hellfeld- und DAPI-Kanälen aufgenommen werden. Stellen Sie sicher, dass die Verstärkung und die Belichtungszeit für die Bildaufnahme für alle Microarrays gleich sind.
2. Ermitteln Sie die durchschnittliche Fluoreszenzintensität jedes Spots im DAPI-Kanal, indem Sie den Spotbereich auswählen und die Fluoreszenz mit einer Bildverarbeitungssoftware quantifizieren.
3. Für die Hintergrundfluoreszenz jedes Spots erhalten Sie Bilder der Polymerflecken auf einem replizierten Microarray, der nur mit Medien ohne Bakterien inkubiert wurde. Ziehen Sie die Hintergrundfluoreszenz von der Intensität des Spots ab, um die Fluoreszenz von Bakterien zu erhalten.
4. Berechnen Sie den durchschnittlichen normalisierten Wert aus den vier Punkten, die jedes Polymer repräsentieren und zum Vergleich der Bakterienbindung verschiedener Polymere verwendet werden.
5. Identifizieren Sie die Polymere, die die geringste bakterielle Bindung (geringste Fluoreszenz) aufweisen, als "Hit"-Polymere.

Materialien