Zubereitung des biolumineszierenden enterohämorrhagischen  Escherichia coli Inokulums

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Methodenartikel

Zubereitung des biolumineszierenden enterohämorrhagischen Escherichia coli Inokulums

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26. September 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Kuo, C., et al. Nachweis der besiedlung durch enterohämorrhagische Escherichia coli im murinen Wirt durch nicht-invasives In vivo Biolumineszenzsystem. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Herstellung einer Luciferase-exprimierenden enterohämorrhagischen Escherichia coli-Suspension aus gefrorenem Bestand zur Verwendung als orales Inokulum in Tiermodellen. Dies ermöglicht die biolumineszierende Echtzeit-Verfolgung der Darmbesiedlung während in vivo Infektionsstudien.

Protokoll

1. Biolumineszierende EHEC-Bakterien (enterohämorrhagische Escherichia coli) Präparat für die orale Inokulation

ANMERKUNG: Das Zeitachsen-Flussdiagramm der experimentellen Verfahren für die EHEC-Präparation und die orale Sonde der Maus ist in Abbildung 1 dargestellt, um die experimentelle Vorbereitung zu erleichtern.

Streifen von E. coli O157:H7 EDL933 Bakterien, die das Luciferase-Plasmid beherbergen, auf eine LB (Luria-Bertani) Agarplatte mit 50 μg/mL Kanamycin aus -80 °C Stamm. Züchten Sie die Bakterien für 16 - 18 h bei 37 °C.
Eine einzelne Kolonie von der Übernachtplatte nehmen und in 3 mL LB Medium mit 50 μg/mL Kanamycin für 16 - 18 h in einem 37 °C Inkubator bei 220 U/min kultivieren.
Subkultur der Bakterien (1:100 Verdünnung) in Kanamycin (50 μg/mL)-haltige LB-Bouillon für 2,5 - 3 h in einem 37 °C Inkubator bei 200 U/min. (Fügen Sie z. B. 2 ml über Nacht kultivierte Bakterien zu 200 ml LB-Medium hinzu, mit Kanamycin (50 μg/ml) ergänzt.)
Inkubieren Sie die Bakterien für 2,5 - 3 h und messen Sie den Wert der optischen Dichte (OD) bei 600 nm (OD₆₀₀), bis der Wert zwischen 0,9 und 1 liegt. Die bakterielle Zellzahl liegt bei einer Dichte von etwa 10⁸ koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml.
Zentrifugieren Sie die rekultivierten Bakterien bei 8.000 x g für 30 min, 4 °C.
Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Bakterienpellet zu rühren, und waschen Sie das Pellet mit 100 mL 0,9 % steriler normaler Kochsalzlösung durch sanftes Rühren.
Wiederholen Sie die Schritte 1.5 und 1.6 einmal.
Nach dem Waschen die Bakterienkultur bei 8.000 x g für 30 min, 4 °C, zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entsorgen.
Kondensieren Sie das Pellet 100-fach mit 0,9 % steriler normaler Kochsalzlösung. Wenn beispielsweise 200 ml Bakterien zentrifugiert werden, fügen Sie 2 ml normale Kochsalzlösung hinzu, um das Pellet zu suspendieren.
Bestätigen Sie den KBE-Wert der Bakterien (er sollte nach der Kondensation in normaler Kochsalzlösung etwa 10⁹ KBE/100 μl betragen), indem Sie die konzentrierten Bakterien durch eine 10-fache serielle Verdünnung plattieren.

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Ergebnisse

Abbildung 1: Zeitleiste des Flussdiagramms für die Versuchsvorbereitung.

Überblick über den Zeitplan, der für die Vorbereitung biolumineszierender EHEC-Bakterien und die Vorbehandlung von Mäusen mit Streptomycin erforderlich ist. A) Vorbereitung der EHE...