Isolierung von antibiotikaresistenten Bakterien aus einer Wasserprobe für die molekulare Analyse

Zusammenfassung

Quelle: Ghadigaonkar, D. und Rath, A. Isolierung und Identifizierung von antibiotikaresistenten Bakterien im Wasser und molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene. J. Vis. Exp. (2023)

Dieses Video zeigt die Isolierung und Aufbereitung von antibiotikaresistenten Bakterien aus einer Wasserprobe unter Verwendung selektiver Medien. Die DNA wird aus antibiotikaresistenten Bakterien extrahiert und amplifiziert, um die bakteriellen antibiotikaresistenten Gene zu identifizieren.

Protokoll

1. Probenentnahme und -verarbeitung

1. Musterkollektion
   1. Entnehmen Sie das entsprechende Volumen der Wasserprobe in sterilen Probenbehältern und stellen Sie sicher, dass nicht mehr als 3/4 des Behälters gefüllt ist.
   2. Transportieren Sie die Proben so schnell wie möglich nach der Entnahme unter aseptischen Bedingungen ins Labor und verarbeiten Sie sie sofort.
2. Probenaufbereitung
   1. Filtern Sie die Wasserprobe aseptisch durch ein steriles Musselintuch, um Partikel zu entfernen.
   2. Führen Sie geeignete serielle Verdünnungen des gefilterten Wassers für die weitere Analyse durch.

2. Abschätzung der Gesamtkeimlast und der Anzahl antibiotikaresistenter Bakterien

1. Bestimmung der Gesamtkeimlast
   1. Suspendieren Sie 18,12 g des modifizierten Pulvers 2A-Agar (R2A-Agar) von Reasoner in 1.000 mL doppelt destilliertem Wasser und lösen Sie die Mischung durch Erhitzen auf. Autoklavieren Sie die gelöste Mischung bei 121 °C, 15 Pfund pro Quadratzoll (psi) für 20 Minuten. Bereiten Sie R2A-Agar-modifizierte Platten vor, indem Sie die entsprechende Menge der autoklavierten Mischung in sterile Petriplatten gießen (z. B. fügen Sie ca. 20 ml autoklaviertes steriles Medium zu einer sterilen 90-mm-Petriplatte hinzu).
   2. Sobald das Medium erstarrt ist, verteilen Sie gleichmäßig 100 μl der entsprechenden Verdünnungen der gefilterten Wasserprobe auf der modifizierten R2A-Agar-Platte. Führen Sie das Experiment in Duplikaten durch.
   3. Inkubieren Sie alle oben genannten Platten 48 Stunden lang bei 35 - 37 °C (variieren Sie die Temperatur und die Inkubationszeit je nach dem für die Isolierung verwendeten Medium).
   4. Die gesamte Bakterienlast wird in koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) mit Hilfe von Gleichung (1) ausgedrückt:
2. Bestimmung der AR-Keimzahl
   1. Führen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.4 aus. Anstelle von R2A-Agar und modifizierten Platten verwenden Sie jedoch R2A-Agar, modifizierte Platten, die individuell mit fünf verschiedenen Antibiotika ergänzt werden, nämlich Cefotaxim (3 μg/ml), Ciprofloxacin (0,5 μg/ml), Erythromycin (20 μg/ml), Kanamycin (15 μg/ml) und Vancomycin (3 μg/ml).
   2. Die Antibiotika werden separat in Röhrchen mit 20 ml sterilem, geschmolzenem R2A-Agar, modifiziert (mit der Temperatur des geschmolzenen R2A-Agars, modifiziert bei ≤40 °C), gegeben, um die endgültige Antibiotikakonzentration zu erreichen, wie in Schritt 2.2.1 beschrieben.
   3. Für ein gleichmäßiges Mischen schwenken und auf sterile Petriplatten gießen, bevor der Agar fest wird. Führen Sie das Experiment in Duplikaten durch.
   4. Inkubieren Sie alle oben genannten Platten bei 35 - 37 °C für 48 h (die Temperatur und die Inkubationszeit können variieren, wenn ein anderes Medium verwendet wird).
   5. Zur Qualitätskontrolle und Überprüfung der Wirksamkeit der Antibiotika werden 100 μl bakterielle Suspensionen der Stämme Escherichia coli ATCC 25922 und Staphylococcus aureus ATCC 29213 auf die jeweiligen antibiotikahaltigen R2A-Agar-Platten aufgebracht (stellen Sie sicher, dass die Dichte der für die Inokulation verwendeten Frischkultur der optischen Dichte entspricht, OD = 0,5 bei 600 nm).
   6. Die Zahl antibiotikaresistenter Keime in Bezug auf KBE/ml ist wie in Schritt 2.1.4 beschrieben zu bestimmen.

3. Identifizierung kultivierbarer Bakterien durch Gensequenzierung der ribosomalen 16S RNA (rRNA)

1. Präparation des DNA-Templates aus den Isolaten für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
   1. Entnehmen Sie mit einem sterilen Zahnstocher eine einzelne, isolierte, reine Kolonie des Isolats, die auf einer Petriplatte wächst. Die Bakterienkolonie in 100 μl sterilem, doppelt destilliertem Wasser in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen suspendieren und 10 Minuten kochen lassen.
   2. Die Suspension wird 2 Minuten lang bei 10.000 × g zentrifugiert, um die Rückstände zu pelletieren, und der Überstand wird in ein frisches steriles Mikrozentrifugenröhrchen überführt, das als Roh-DNA-Template verwendet wird.
2. Gezielte PCR-Amplifikation der V3-Region des 16S rRNA-Gens und Sequenzierung
   1. Bereiten Sie 40 μl des Reaktionsgemisches in einem PCR-Röhrchen für die PCR-Amplifikation vor, wie in Tabelle 1 beschrieben.
      ANMERKUNG: Die DNA-Präparation sollte auf einem Eisblock durchgeführt werden, wobei die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination minimiert werden sollte (Tragen Sie beim Umgang mit den Reagenzien Handschuhe und reinigen Sie die Arbeitsfläche gründlich mit 70% Ethanol).
   2. Platzieren Sie das Röhrchen in den Thermoblock und führen Sie das entsprechende Programm im PCR-Thermocycler aus. In Tabelle 2 finden Sie die standardisierten PCR-Cycling-Bedingungen und die Primer-Informationen für die Amplifikation der V3-Regionen der 16S rRNA-Gene.

Tabelle 1: Bestandteile des PCR-Mastermixes. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches verschiedener PCR-Reagenzien.

PCR-Reagenzien	Volumen (μL)
2x Taq-Mastermischung	20
Forward Primer (10 Picomol)	1.5
Umgekehrte Grundierung (10 Pico Mol)	1.5
Rohe DNA-Vorlage	1.5
Steriles Wasser für die Molekularbiologie	15.5
Gesamtvolumen	40

 

 

 

 

 

 

 

Tabelle 2: PCR-Zyklusbedingungen für die Amplifikation des 16S rRNA-Gens. Die PCR-Zyklusbedingungen, die für die Amplifikation des 16S-rRNA-Gens erforderlich sind, sind dargestellt. Die Schritte umfassen einen ersten Denaturierungsschritt, gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung, des Glühens und der Verlängerung sowie eines abschließenden Verlängerungsschritts.

Richtung	Grundierung Sequenz 5' – 3'	PCR-Bedingungen	Nein. Anzahl der Zyklen
Vorwärts	GGAGGCAGCAGTAAGGAAT	94 °C für 10 min	1
		Denaturierung bei 94 °C für 30 s	35
		Glühen bei 50 °C für 30 s
		Ausdehnung bei 72 °C für 40 s
Rückwärts	CTACCGGGGTATCTAATCC	Abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 min	1

Materialien