Ein Co-Kultivierungssystem zur Untersuchung der molekularen Reaktionen von pflanzlichen Wirten und interagierenden Bakterien

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Nathoo, N., et al. Ein hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur gleichzeitigen und systematischen Analyse der molekularen Interaktionen und Signalwege von Pflanzen und Mikroben. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video zeigt ein hydroponisches Co-Kultivierungssystem zur Untersuchung von Pflanzen-Bakterien-Interaktionen unter sterilen Bedingungen. Die Pflanzensämlinge werden in ein steriles, saures Wachstumsmedium überführt, inkubiert und auf Kontamination untersucht, bevor sie mit Agrobacterium geimpft werden. Die aktivierten Bakterien heften sich an Pflanzenwurzeln, übertragen T-DNA in Pflanzenzellen und fördern molekulare Veränderungen, die die bakterielle Besiedlung fördern.

Protokoll

1. Hydroponisches Co-Anbausystem

Bereiten Sie flüssiges Murashige und Skoog (MS) Medium vor: 2,165 g/l MS-Basalsalze, 10 g/l Saccharose, 0,25 g/l 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) und 59 ml/l B5-Vitaminmischung, pH 5,75.
Autoklavieren Sie das Medium. Gießen Sie 18 mL davon in jeden sterilen zylindrischen Glas- oder Klarsichtkunststofftank (Kristallisationsschalen, 100 x 80 mm2) mit sterilen Deckeln.
ANMERKUNG: Sterilisieren Sie die Tanks und Deckel vor, indem Sie sie in Aluminiumfolie einwickeln und autoklavieren.
Verwenden Sie in einer sterilisierten Fließhaube eine sterile Pinzette, um jedes Maschenquadrat mit 10-14 Tage alten Sämlingen vorsichtig aus dem halbfesten Medium in einen hydroponischen zylindrischen Tank zu übertragen (Abbildung 1d). Verschließen Sie die Deckel mit porösem chirurgischem Klebeband auf den Tanks.
Kultivieren Sie die Sämlinge 72 Stunden lang bei 22-24 °C auf dem Gitter im Tank, mit einer 16-stündigen Photoperiode und Schütteln bei 50 U/min zur Belüftung (Abbildung 1e).
ANMERKUNG: Dies ermöglicht es den Pflanzen, sich vor der Inokulation (Co-Kultivierung) mit Mikroorganismen an die hydroponische Umgebung anzupassen. Diese Wartezeit ermöglicht es auch, dass eine versehentliche mikrobielle Kontamination vor der Impfung sichtbar wird.
1. Beginnen Sie den nächsten Schritt am Tag vor dem Ende der Inkubationszeit.
Agrobacterium tumefaciens in Agrobacterium (AB)-Medium (0,5 % w/v Hefeextrakt, 0,5 % w/v Trypton, 0,5 % w/v Saccharose, 50 mM MgSO₄, pH 7,0) bei 28 °C unter Schütteln über Nacht züchten, bis die Kultur eine endgültige optische Dichte von 1,0 bei 600 nm (OD₆₀₀) erreicht, gemessen mit einem Spektralphotometer, mit unbeimpftem AB-Medium als Blindwert.
ANMERKUNG: Ein OD₆₀₀ von 1,0 entspricht etwa 10⁹ Zellen/ml.
Waschen Sie A . tumefaciens dreimal in einem gleichen Volumen von 0,85 % NaCl. In einem gleichen Volumen sterilem doppelt destilliertem Wasser resuspendieren.
Untersuchen Sie vor der Impfung den Tank mit den Setzlingen sorgfältig, um sicherzustellen, dass keine Kontamination vorliegt. Das Medium in den nicht kontaminierten Tanks sollte klar und transparent sein.
1. Entsorgen Sie alle Tanks mit trüber Flüssigkeit (Verschmutzung) und nummerieren Sie die restlichen Tanks. Nehmen Sie eine kleine Menge (20 μl) hydroponisches Medium aus jedem nummerierten Tank und verteilen Sie es auf eine mit Luria-Brühe (LB) gefüllte Petrischale. Die Schale bei 28 °C inkubieren.
Geben Sie sofort 50 μl der A. tumefaciens-Suspension (ca. 5 x 10⁷ Zellen, geschätzt aus dem OD₆₀₀) in jeden nummerierten Hydrokulturtank. Kultivieren Sie die Sämlinge von Arabidopsis thaliana und A. tumefaciens bei 22-24 °C mit einer 16-stündigen Photoperiode und Schütteln bei 50 U/min (Abbildung 3f).
1. Untersuchen Sie die gefleckte LB-Platte aus Schritt 1.7.1. nach 12 und 28 h Inkubation, um die Sterilität der Tanks zu überprüfen. Im Falle einer Kontamination ist der entsprechende nummerierte Tank (mit Bakterien beimpft) nicht für weitere nachgelagerte Assays zu verwenden.
Falls gewünscht, überwachen Sie das Wachstum von A. tumefaciens in regelmäßigen Abständen, indem Sie eine Probe des Mediums aus dem Tank entnehmen und den OD₆₀₀ mit einem Spektralphotometer mit Medium aus einer nicht inokulierten Kontrolle als Blindwert messen (Abbildung 2).
ANMERKUNG: Die Symptome der Pflanzenkrankheit sollten nach 7 Tagen sichtbar sein (Abbildung 3).

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Ergebnisse

Abbildung 1: Hydroponisches Pflanzen-Mikroben-Co-Kultivierungssystem. Das linke Feld zeigt ein Flussdiagramm, das die sechs wichtigsten Schritte bei der Montage und dem Betrieb des hydroponischen Co-Kultivierungssystems beschreibt. Das rechte B...