$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Vorbereitung der Lösung
- 1 M Tris-Cl, pH 7,8, wird durch Auflösen von 10,34 g Tris HCl und 4,17 g Tris OH in 50 mL dH2O in einem 125 mL Kolben hergestellt. Durch Filtrieren durch einen 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit einer 0,2-μm-Membran sterilisieren und in einem konischen Röhrchen bei Raumtemperatur lagern.
- Lösung A (20 mM MgCl2, 0,7 M Saccharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) wird durch Auflösen von 0,10 g MgCl2 (95,2 g/mol) und 11,98 g Saccharose (342,3 g/mol) in 25 mL dH2O in einem 125 mL Kolben hergestellt. Fügen Sie 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) hinzu und stellen Sie das Volumen auf 50 mL ein. Durch Filtrieren durch einen 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit einer 0,2-μm-Membran sterilisieren und in einem konischen Röhrchen bei Raumtemperatur lagern.
- Lösung B (10 mM MgCl2, 0,8 M Saccharose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) wird durch Auflösen von 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) und 13,69 g Saccharose (342,3 g/mol) in 25 mL dH2O in einem 125 mL Kolben hergestellt. Fügen Sie 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) hinzu und stellen Sie das Volumen auf 50 mL ein. Durch Filtrieren durch einen 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit einer 0,2-μm-Membran sterilisieren und in einem konischen Röhrchen bei Raumtemperatur lagern.
- 0,8 M Saccharose wird durch Auflösen von 13,69 g Saccharose (342,3 g/mol) in 50 mL dH2O in einem 125 mL Kolben hergestellt. Durch Filtrieren durch einen 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit einer 0,2-μm-Membran sterilisieren und in einem konischen Röhrchen bei Raumtemperatur lagern.
- 5 mg/ml Desoxyribonuklease I (DNase I) werden durch Auflösen von 0,015 g DNase I in 3 ml dH2O in einem 50-ml-Kolben hergestellt. Sterilisieren Sie durch Filtrieren durch einen 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit einer 0,2-μm-Membran. Die Lösung in Mikrofuge-Röhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- 0,125 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) mit einem pH-Wert von 8,0 werden durch Auflösen von 0,698 g EDTA-Dinatriumdehydrat (372,2 g/mol) in 15 mL dH2O in einem 125-ml-Kolben hergestellt. Durch Filtrieren durch einen 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit einer 0,2-μm-Membran sterilisieren und in einem konischen Röhrchen bei Raumtemperatur lagern.
- Bereiten Sie 600 μg/ml Cephalexin vor, indem 0,03 g Cephalexinhydrat (365,404 g/mol) in 50 ml dH2O in einem 125-ml-Kolben gelöst werden. Durch Filtrieren durch einen 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit einer 0,2-μm-Membran sterilisieren und in einem konischen Röhrchen bei 4 °C lagern.
- Bereiten Sie 5 mg/ml Lysozym vor, indem 0,015 g Lysozym in 3 ml dH2O in einem 50-ml-Kolben gelöst werden. Sterilisieren Sie durch Filtrieren durch einen 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit einer 0,2-μm-Membran. Die Lösung in Mikrofuge-Röhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- 3 % w/v Trypticase-Sojabrühe (TSB) werden durch Auflösen von 30 g TSB in 1 l dH2O in einem 2-l-Kolben hergestellt. Aliquotiert die Lösung in Kolben mit 25 ml oder 100 ml TSB zur Verwendung bei der Herstellung von E. coli Sphäroplasten. Autoklavkolben zur Sterilisation des flüssigen Mediums. Steriles TSB kann entweder bei Raumtemperatur oder 4 °C gelagert werden.
2. Vorbereitung der Übernachtkultur
ANMERKUNG: Die Abschnitte 2-3 werden mit geeigneten sterilen Techniken durchgeführt. Falls gewünscht, kann ein Bakterienstamm ein Plasmid für Antibiotikaresistenz enthalten, um die potenzielle Kontamination zu reduzieren. Wenn Sie einen Stamm mit Antibiotikaresistenz verwenden, fügen Sie die notwendigen Antibiotika in den Schritten 2.1 und 3.1–3.2 hinzu.
- Bereiten Sie eine Übernachtkultur vor, indem Sie mit einer sterilen Pipettenspitze eine einzelne Bakterienkolonie auswählen und in ein 14-ml-Kulturröhrchen mit 2–3 ml 3 % w/v TSB geben. Inkubieren bei 37 °C und Schütteln 16–21 Stunden lang.
3. Herstellung von gramnegativen E. coli Sphäroplasten
- In einem 250-ml-Kolben wird die Übernachtkultur 1:100 in einem Volumen von 25 ml mit 3 % w/v TSB verdünnt und die bakterielle Lösung bei 37 °C inkubiert, während die Lösung etwa 2,5 h lang geschüttelt wird, bis die Lösung bei 600 nm eine optische Dichte von 0,5–0,8 erreicht hat. Messen Sie die optische Dichte mit einem Spektralphotometer.
- In einem 250-ml-Kolben wird diese Kultur 1:10 in 30 ml 3 % w/v TSB verdünnt und bei 37 °C inkubiert, während er 2,5 h lang in Gegenwart von 60 μg/ml Cephalexin (347,4 g/mol) geschüttelt wird, um einzellige Filamente mit einer Länge von etwa 50–150 μm zu erzeugen, die unter 1.000-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop beobachtbar sind (Abbildung 1B).
- Ernten Sie die Filamente, indem Sie die Bakterienlösung bei 1.500 x g, 4 °C für 4 min zentrifugieren. Dekantieren und entsorgen Sie den Überstand, wobei Sie das Pellet aufbewahren.
- Waschen Sie die Filamente, indem Sie vorsichtig 1 mL 0,8 M Saccharose hinzufügen, wobei Sie darauf achten müssen, das Pellet nicht zu stören. 1 Minute inkubieren und dann den Überstand entsorgen, ohne das Pellet zu stören.
- Geben Sie 150 μl 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 μl 5 mg/ml Lysozym, 30 μl 5 mg/ml DNase I und 120 μl 0,125 M EDTA in der jeweiligen Reihenfolge zum Pellet und inkubieren Sie die Lösung 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Geben Sie 1 ml Lösung A schrittweise über 1 Minute mit einer Mikropipette in die in 3.5 hergestellte Lösung, während Sie die Lösung vorsichtig von Hand schwenken. Inkubieren Sie die Lösung 4 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- 7 mL 4 °C Lösung B in zwei konische 15 mL Röhrchen geben. Die in Nummer 3.6 hergestellte Lösung wird in gleicher Menge in jedes dieser beiden Röhrchen gegeben. Die Lösung bei 1.500 x g, 4 °C für 4 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie mit einer serologischen Pipette vorsichtig alle bis auf 1-2 ml Überstand, ohne das Pellet zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet, indem Sie es vorsichtig mit einer P1000-Mikropipette auf und ab pipettieren. Überprüfen Sie visuell, ob sich Sphäroplasten bilden, indem Sie die Probe mit einem Lichtmikroskop bei 1.000-facher Vergrößerung beobachten (Abbildung 1C).
- Lagern Sie die Sphäroplasten bis zu einer Woche lang bei -20 °C oder bis sie 3 Gefrier-Tau-Zyklen durchlaufen haben.
