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1. Vorbereitung der Lösung
- Bereiten Sie 5 mg/ml Lysozym vor, indem 0,015 g Lysozym in 3 ml dH2O in einem 50-ml-Kolben gelöst werden. Sterilisieren Sie durch Filtrieren durch einen 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit einer 0,2-μm-Membran. Die Lösung in Mikrofuge-Röhrchen aliquotieren und bei -20 °C lagern.
- 3 % w/v Trypticase-Sojabrühe (TSB) werden durch Auflösen von 30 g TSB in 1 l dH2O in einem 2-l-Kolben hergestellt. Aliquotieren Sie die Lösung in Kolben mit 100 ml TSB zur Herstellung von B. megaterium-Protoplasten . Autoklavkolben zur Sterilisation des flüssigen Mediums. Steriles TSB kann entweder bei Raumtemperatur oder 4 °C gelagert werden.
- Lösung C (1 M Saccharose, 0,04 M Maleat, 0,04 M MgCl2, pH 6,5) wird durch Auflösen von 34,23 g Saccharose (342,3 g/mol), 0,46 g Maleinsäure (116,07 g/mol) und 0,38 g MgCl2 (95,21 g/mol) in 100 mL dH2O in einem 250 mL Kolben hergestellt. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5 ein. Durch Filtrieren durch einen 25-mm-Spritzenvorsatzfilter mit einer 0,2-μm-Membran sterilisieren und in einem konischen Röhrchen bei Raumtemperatur lagern.
- Bereiten Sie 200 mL Protoplastenmedium vor, indem Sie 100 mL 3 % w/v TSB und 100 mL Lösung C in einer 1 l Glasflasche mischen. Autoklavieren Sie die Lösung, um sie zu sterilisieren und bei Raumtemperatur zu lagern.
2. Herstellung von grampositiven B. megaterium Protoplasten
- In einem 250-ml-Kolben wird die Übernachtkultur 1:1.000 in 100 mL mit 3 % w/v TSB verdünnt und die bakterielle Lösung bei 37 °C inkubiert, während sie etwa 4,5 h lang geschüttelt wird, bis die Lösung bei 600 nm eine optische Dichte von 0,9-1,0 erreicht hat. Messen Sie die optische Dichte mit einem Spektralphotometer.
- Gießen Sie die Flüssigkultur in zwei konische 50-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 2.000 x g, 4 °C.
- Entsorgen Sie mit einer serologischen Pipette den Überstand aus beiden konischen Röhrchen. Resuspendieren Sie jedes Pellet in 2,5 mL Protoplastenmedium und kombinieren Sie die resuspendierten Lösungen in einem einzigen konischen Röhrchen. Die kombinierte resuspendierte Lösung wird in einen 125-ml-Kolben pipettiert.
- 1 ml 5 mg/ml Lysozym zugeben und 1 h bei 37 °C unter Schütteln inkubieren.
- Überwachen Sie das Wachstum von Protoplasten unter 1.000-facher Vergrößerung mit einem Lichtmikroskop und achten Sie auf Unregelmäßigkeiten, wie z. B. Bakterien, die als geschwollene Stäbchen anstelle von Kugeln erscheinen (Abbildung 1). Mit einer serologischen Pipette die Lösung in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführen und 10 Minuten lang bei 2.000 x g, 4 °C zentrifugieren.
- Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 5 mL Protoplastenmedium. Lagern Sie Protoplasten bis zu einer Woche lang bei -20 °C oder bis sie 3 Gefrier-Tau-Zyklen durchlaufen haben.
