Beurteilung der Transzytose von E. coli über intestinale Epithelmonoschichten

Zusammenfassung

Quelle: Islam, A., et al., Bewertung der intestinalen Transzytose von neonatalen Escherichia coli Bakteriämie-Isolaten. J. Vis. Exp. (2023)

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Beurteilung der Transzytose von neonatalen Escherichia coli über intestinale Epithelmonoschichten unter Verwendung von Transwell-Inserts, elektrischer Widerstandsmessung und bakterieller Quantifizierung.

Protokoll

1. Inokulation der Zellen (Start des Versuchs)

1. Nach genau 2 h die morgendlichen Bakterienkulturen aus dem Shaker nehmen und 10 min (1.900 x g, 4 °C) zentrifugieren.
   ANMERKUNG: Bewahren Sie für alle folgenden Schritte alle bakteriellen Suspensionen auf Eis auf, um das Wachstum zu minimieren.
2. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet im Gewebekulturmedium (TCM) ohne Antibiotika. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die optische Dichte (OD) auf 0,7-0,9 einzustellen, und verdünnen Sie weiter mit TCM ohne Antibiotika auf eine Konzentration von 1 x 10⁶ koloniebildende Einheiten (KBE)/ml (ca. 1:100 Verdünnung). Verwenden Sie diese Bakteriensuspension, um jeden Einsatz mit 1 x 10⁵ KBE pro 100 μl Volumen zu infizieren.
3. Markieren Sie die Transwell-Platte und infizieren Sie jeden Einsatz mit 100 μl des OD-angepassten Inokulums (insgesamt 1 x 10⁵ KBE pro Einsatz). Die Analyse hat nun begonnen. Notieren Sie sich die Uhrzeit und notieren Sie sie als t = 0 h.
4. Die bakterielle Suspension des Inokulums wird zur Quantifizierung der KBE/ml unter Verwendung der Spurverdünnungsmethode plattiert, indem 10 μL Aliquots auf quadratische LB-Agarplatten plattiert werden.

2. Quantifizierung der Transzytose

1. Füllen Sie alle 30 Minuten nach der Inokulation neue Vertiefungen mit 500 μl TCM ohne Antibiotika. Übertragen Sie die Einsätze in diese neuen Vertiefungen, indem Sie für jeden Bakterienstamm einen anderen Satz steriler Pinzetten verwenden.
2. Sammeln Sie das Medium aus der gebrauchten Auffangwanne für jeden Einsatz in separate beschriftete Röhrchen. Lege diese Röhren auf Eis. Bringen Sie die Transwell-Platten zwischen den Zeitpunkten wieder in den Inkubator zurück.
3. Kombinieren Sie für jede Einlage die gesammelten Medien aus t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h und t = 2 h und wirbeln Sie kurz vortexen. Plattieren Sie das gesammelte Medium auf Luria-Bertani (LB)-Agarplatten unter Verwendung der Spurverdünnungsmethode, um die Menge der in den ersten 2 h des Experiments transzytierten Bakterien zu quantifizieren.
   ANMERKUNG: Durch die Entnahme der Bakterien alle 30 Minuten und deren Aufbewahrung auf Eis wird das Bakterienwachstum in den Auffangwannen minimiert, und die Messungen werden an überwiegend Transzytosebakterien durchgeführt.
4. Legen Sie die markierten Spurverdünnungs-LB-Agarplatten in den Bakterieninkubator bei 37 °C ohne zusätzliches CO₂ und stellen Sie die T84-Transwell-Platte wieder in den Gewebekultur-Inkubator ein.
5. Bei t = 4 h wiederholen Sie Schritt 2.3, indem Sie die gesammelten Medien aus t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h und t = 4 h kombinieren.
6. Bei t = 6 h wird Schritt 2.3 wiederholt, indem die gesammelten Medien aus t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h und t = 6 h kombiniert werden. Zusätzlich wird bei t = 6 h das Medium aus den Kontrollvertiefungen plattiert.

3. Ende des Versuchs

1. Messen und protokollieren Sie den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) am Ende des Experiments, t = 6 h.
2. Dekontaminieren Sie die Sonde, indem Sie sie 10-15 Minuten lang in 70%iges Ethanol tauchen. Falls gewünscht, verwerfen Sie die Einsätze oder bewahren/verarbeiten Sie sie für weitere Anwendungen. Lassen Sie die LB-Agarplatten über Nacht inkubieren und desinfizieren und/oder entsorgen Sie alle anderen verwendeten Materialien sicher.
3. Nach der Inkubation über Nacht werden die Bakterienkolonien manuell auf den Spurverdünnungs-LB-Platten gezählt, um die Inokulummenge und die Menge der E . coli-Transzytose zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die Kontrollplatten kein Bakterienwachstum aufweisen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
15 mL sterile konische Röhrchen	MidSci	C15B
2 mL Mikrozentrifugenröhrchen	Avant	AVSS2000
50 mL sterile konische Röhrchen aus Polypropylen	Falke	352070
Zentrifuge	Sorvall	Legende RT
Einweg-Impfösen	Fisherbrand	22363605
Dulbeccos modifizierter Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Epithel-Volt/Ohm-Messgerät	Welt Präzisionsinstrumente	EVOM
Schüttler für Inkubator	Neubraunschweig	Innova 4080
Inkubatoren	Thermo Scientific	51030284	Drei davon werden in der Methode verwendet: eine für die sterile Gewebekultivierung, eine für die Kultivierung von infiziertem Gewebe und eine für die bakterielle Inkubation.
Lysogeny Brühe	Difco	244610
Lysogeny-Bouillon-Agar	IBI Wissenschaftlich	IB49101
Spektralphotometer	Unico	1100RS
T84 Darmzellen	Amerikanische Gewebekultur-Kollektion	CCL248
Gewebekultureinsätze, mit Polyethylen-Trephthalat-Membran, 3 μm Poren, 24-Well-Format	Falke	353096
Gewebekulturplatte, 24 Vertiefungen	Falke	353504