$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Inokulation der Zellen (Start des Versuchs)
- Nach genau 2 h die morgendlichen Bakterienkulturen aus dem Shaker nehmen und 10 min (1.900 x g, 4 °C) zentrifugieren.
ANMERKUNG: Bewahren Sie für alle folgenden Schritte alle bakteriellen Suspensionen auf Eis auf, um das Wachstum zu minimieren. - Resuspendieren Sie das Bakterienpellet im Gewebekulturmedium (TCM) ohne Antibiotika. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die optische Dichte (OD) auf 0,7-0,9 einzustellen, und verdünnen Sie weiter mit TCM ohne Antibiotika auf eine Konzentration von 1 x 106 koloniebildende Einheiten (KBE)/ml (ca. 1:100 Verdünnung). Verwenden Sie diese Bakteriensuspension, um jeden Einsatz mit 1 x 105 KBE pro 100 μl Volumen zu infizieren.
- Markieren Sie die Transwell-Platte und infizieren Sie jeden Einsatz mit 100 μl des OD-angepassten Inokulums (insgesamt 1 x 105 KBE pro Einsatz). Die Analyse hat nun begonnen. Notieren Sie sich die Uhrzeit und notieren Sie sie als t = 0 h.
- Die bakterielle Suspension des Inokulums wird zur Quantifizierung der KBE/ml unter Verwendung der Spurverdünnungsmethode plattiert, indem 10 μL Aliquots auf quadratische LB-Agarplatten plattiert werden.
2. Quantifizierung der Transzytose
- Füllen Sie alle 30 Minuten nach der Inokulation neue Vertiefungen mit 500 μl TCM ohne Antibiotika. Übertragen Sie die Einsätze in diese neuen Vertiefungen, indem Sie für jeden Bakterienstamm einen anderen Satz steriler Pinzetten verwenden.
- Sammeln Sie das Medium aus der gebrauchten Auffangwanne für jeden Einsatz in separate beschriftete Röhrchen. Lege diese Röhren auf Eis. Bringen Sie die Transwell-Platten zwischen den Zeitpunkten wieder in den Inkubator zurück.
- Kombinieren Sie für jede Einlage die gesammelten Medien aus t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h und t = 2 h und wirbeln Sie kurz vortexen. Plattieren Sie das gesammelte Medium auf Luria-Bertani (LB)-Agarplatten unter Verwendung der Spurverdünnungsmethode, um die Menge der in den ersten 2 h des Experiments transzytierten Bakterien zu quantifizieren.
ANMERKUNG: Durch die Entnahme der Bakterien alle 30 Minuten und deren Aufbewahrung auf Eis wird das Bakterienwachstum in den Auffangwannen minimiert, und die Messungen werden an überwiegend Transzytosebakterien durchgeführt. - Legen Sie die markierten Spurverdünnungs-LB-Agarplatten in den Bakterieninkubator bei 37 °C ohne zusätzliches CO2 und stellen Sie die T84-Transwell-Platte wieder in den Gewebekultur-Inkubator ein.
- Bei t = 4 h wiederholen Sie Schritt 2.3, indem Sie die gesammelten Medien aus t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h und t = 4 h kombinieren.
- Bei t = 6 h wird Schritt 2.3 wiederholt, indem die gesammelten Medien aus t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h und t = 6 h kombiniert werden. Zusätzlich wird bei t = 6 h das Medium aus den Kontrollvertiefungen plattiert.
3. Ende des Versuchs
- Messen und protokollieren Sie den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) am Ende des Experiments, t = 6 h.
- Dekontaminieren Sie die Sonde, indem Sie sie 10-15 Minuten lang in 70%iges Ethanol tauchen. Falls gewünscht, verwerfen Sie die Einsätze oder bewahren/verarbeiten Sie sie für weitere Anwendungen. Lassen Sie die LB-Agarplatten über Nacht inkubieren und desinfizieren und/oder entsorgen Sie alle anderen verwendeten Materialien sicher.
- Nach der Inkubation über Nacht werden die Bakterienkolonien manuell auf den Spurverdünnungs-LB-Platten gezählt, um die Inokulummenge und die Menge der E . coli-Transzytose zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die Kontrollplatten kein Bakterienwachstum aufweisen.