Dieses Video zeigt die Herstellung einer genetisch veränderten Borrelia burgdorferi-Kultur , die mit ruhender Bakteriophagen-DNA hergestellt wurde, die ein Antibiotikaresistenzgen trägt. Nach der Auswahl und Inkubation von Antibiotika löst ein chemischer Induktor DNA-Schäden aus, die zur Exzision, Replikation und Assemblierung neuer Virionen führen, die das Resistenzgen enthalten. Nach einer zweiten Zentrifugation und Resuspension sind die Bakterienzellen, die reife Viruspartikel beherbergen, bereit für nachgelagerte Anwendungen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Präparation und Induktion von Borrelia burgdorferi-Kulturen für die Herstellung von Viruspartikeln
764 Aufrufe
⸱
26. September 2025
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Protokoll
1. Vorbereitung der B. burgdorferi-Kultur für die Produktion von φBB-1
- Bereiten Sie Barbour-Stoenner-Kelly Medium zu, das mit 6,6 % hitzeinaktiviertem normalem Kaninchenserum (BSK) ergänzt wird. Für 1 l 1x BSK die in Tabelle 1 aufgeführten Komponenten in 900 mL Wasser mischen, den pH-Wert mit 1 N Natriumhydroxid auf 7,6 einstellen und 2-4 h langsam bei 4 °C mischen. Nach Abschluss des Mischens den pH-Wert prüfen und gegebenenfalls auf 7,6 einstellen und das Volumen mit Wasser auf 1 l erhöhen. Sterilisieren Sie das Medium, indem Sie es durch einen 0,22-μM-Filter passieren (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie es frisch oder lagern Sie es ≤2 Monate lang bei 4 °C.
- Drei bis fünf Tage vor Beginn des Transduktionsprotokolls inokulieren Sie 150 μl des/der entsprechenden B. burgdorferi-Klon (e) in 15 mL 1x BSK in dicht verschlossenen sterilen konischen Zentrifugenröhrchen (siehe Materialtabelle). Ergänzen Sie das Medium mit der entsprechenden Konzentration von Antibiotika oder einer Kombination von Antibiotika für die Selektion und Erhaltung heterologer DNA innerhalb des/der B . burgdorferi-Klon (e) (Tabelle 2).
HINWEIS: B. burgdorferi ist ein Organismus der Biosicherheitsstufe 2. Treffen Sie alle geeigneten Vorsichtsmaßnahmen, wenn Sie mit diesem Organismus arbeiten. Führen Sie alle Arbeiten mit lebenden Kulturen von B. burgdorferi in einer zertifizierten und ordnungsgemäß desinfizierten Biosicherheitswerkbank der Klasse II durch. Entsorgen Sie sämtliches Material, das mit B. burgdorferi und den Organismen selbst in Berührung kommt, gemäß den Richtlinien der Centers for Disease Control and Prevention (CDC). - Die Kulturen werden bei 33 °C ohne Schütteln inkubiert, bis die Kulturen eine Dichte von ≥5 × 107 Spirochäten·mL−1 erreicht haben, was etwa 3-5 Tage dauert.
3. Induktion von B. burgdorferi phage φBB-1
HINWEIS: Sterilisieren Sie alle Glas- und Kunststoffwaren durch Autoklavieren; Sterilisieren Sie alle Lösungen durch Autoklavieren oder Filtrieren durch einen 0,22-μM-Filter. Die folgenden Schritte basieren auf Volumina von 15 ml, aber die Methode ist je nach den individuellen Anforderungen des Experiments auf kleinere oder größere Volumina skalierbar.
- Für die B. burgdorferi-Kultur , aus der Phagen hergestellt werden sollen (der Spender), verwenden Sie die Konzentration, die nach einer der beiden Methoden in Schritt 2 berechnet wurde, um das Volumen der Starterkultur zu bestimmen, das erforderlich ist, um 4 ml von 2 × 108 Spirochäten zu erhalten. ml-1. Dies ergibt eine Endkonzentration von 5 × 107 Spirochäten·mL-1 in 15 mL während der Erholungsphase (Schritt 3.6 unten).
- Das in Schritt 3.1 berechnete Kulturvolumen wird bei 6.000 x g für 10 min zentrifugiert. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 4 ml frischem BSK. Übertragen Sie die Probe in das kleinste verfügbare sterile Röhrchen, um die Probe mit minimalem Kopfraum aufzunehmen.
- Geben Sie die entsprechende Menge des Induktionsmittels in die empfohlene Konzentration (Tabelle 3) basierend auf einem Kulturvolumen von 4 ml, um die Phagenproduktion zu induzieren. Verschließen Sie die Tube fest und mischen Sie sie gründlich.
- Inkubieren Sie die Probe bei 33 °C für 2-4 h.
- Nach der Inkubation wird die Probe in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt. Zentrifugieren Sie die Probe bei 6.000 x g für 10 min. Dekantieren Sie den Überstand.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 15 mL 1x BSK.
Tabelle 1: BSK für die Kultivierung und Selektion von B. burgdorferi-Klonen für Transduktionsassays. Die Formulierung und Herstellung von 1x BSK für die Kultivierung von B. burgdorferi und 1,5x BSK für die Festphasenselektion von B. burgdorferi-Klonen , die hier beschrieben werden, basieren auf Samuels. Verschiedene Formulierungen von BSK (oder MKP), die das Wachstum von B. burgdorferi unterstützen, wurden bisher nicht mit dem Transduktionsassay getestet.
| Bestandteil | 1x BSK (zum Kultivieren) (1 L) | 1,5x BSK (zum Plattieren) (1 L) |
| Rinderserumalbumin (Fraktion V) | 35 g | 52,5 Gramm |
| 10x CMRL-1066 (ohne L-Glutamin) | 8 g | ca. 12 g |
| Neopepton | 4 g | 6 g |
| Hefe | ca. 1,6 g | ca. 2,4 g |
| HEPES | 4,8 g | 7,2 g |
| Traubenzucker | 4 g | 6 g |
| Natriumcitrat | 0,56 Gramm | 0,84 Gramm |
| Natriumpyruvat | 0,64 Gramm | 0,96 Gramm |
| N-Acetyl-Glucosamin | 0,32 Gramm | 0,48 Gramm |
| Natriumbicarbonat | ca. 1,76 Gramm | ca. 2,64 Gramm |
| Hitzeinaktiviertes normales Kaninchenserum (INRS) | 66 mL | 99 mL |
Tabelle 2: Potentielle Antibiotika und Konzentrationen, die für die Selektion und Erhaltung heterologer DNA in B. burgdorferi verwendet werden können. Diese Liste basiert auf den aktuellen antibiotikaresistenten Markern, die bei Borrelia burgdorferi häufig verwendet werden. Kanamycin, Gentamicin und Streptomycin werden in Wasser hergestellt, durch einen 0,22-μM-Filter filtriert und bei -20 °C gelagert. Erythromycin wird in 95 % Ethanol hergestellt und bei -20 °C gelagert. Viele Laboratorien berichten von der erfolgreichen Verwendung von Kanamycin zur Selektion bei einer Konzentration von 200 μg·mL-1; Bei Verwendung von Gentamicin und Kanamycin zur Selektion in Transduktionsassays wird 400 μg·mL-1 Kanamycin verwendet. Das aadA-Gen verleiht Resistenz sowohl gegen Streptomycin als auch gegen Spectinomycin. Für die Selektion von Konstrukten, die das aadA-Gen in E enthalten. coli, 100 μg·mL−1 Spectinomycin wird verwendet. Beachten Sie, dass die Aminoglykoside (Kanamycin, Gentamicin und Streptomycin) bei der Behandlung der Lyme-Borreliose klinisch nicht relevant sind; Erythromycin wird jedoch in bestimmten Situationen klinisch eingesetzt. Obwohl über eine natürliche Resistenz gegen dieses Antibiotikum bei B. burgdorferi berichtet wurde, wurde dieser Resistenzmarker in den hier berichteten Transduktionsassays bisher nicht verwendet.
| Antibiotikum | Bestandskonzentration | Abschließende Konzentration in der Kultur von Bb |
| Kanamycin | 100 mg.mL-1 (im Wasser) | 200-400 μ g.mL-1 Zoll |
| Gentamicin | 50 mg.mL-1 (im Wasser) | 50 μ g.mL-1 Zoll |
| Streptomycin | 50 mg.mL-1 (im Wasser) | 50 μ g.mL-1 Zoll |
| Erythromycin | 2 mg.mL-1 (in EtOH) | 0,06 μ g.mL-1 |
Tabelle 3: Potentielle Induktionsstoffe und Konzentrationen, die für die Induktion von φBB-1 aus B. burgdorferi verwendet werden. Es wurde gezeigt, dass N-Methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG), Mitomycin C und Ethanol sowie Methanol und Isopropanol φBB-1 über den konstitutiven Werten im B. burgdorferi-Stamm CA.11-2A induzieren. MNNG steht im Verdacht, krebserregend und umweltschädlich zu sein; Mit Vorsicht verwenden, in einem brennbaren Lösungsmittel auflösen und zur Entsorgung verbrennen. Mitomycin C steht im Verdacht, krebserregend zu sein und eine potenzielle Gefahr für die Umwelt zu verursachen. Mit Vorsicht unter einem chemischen Abzug verwenden und ordnungsgemäß entsorgen. Während veröffentlichte Daten darauf hindeuten, dass MNNG das wirksamste Mittel zur Induktion von φBB-1 ist, machen die Gefahren der Arbeit mit dieser Chemikalie und die Schwierigkeiten bei ihrer Beschaffung ihre Verwendung kompliziert, insbesondere bei Studenten. Die Induktion mit Ethanol ist durchweg besser als mit Methanol oder Isopropanol und wird am häufigsten im Transduktionsassay verwendet.
| Induzierendes Mittel | Stammkonzentration (Lösungsmittel) | Endkonzentration in der Probe |
| Ethanol | 100% (keine) | 5% |
| Mitomycin C | 2 mg.mL-1 (Wasser) | 20 μ g.mL-1 Zoll |
| 1-Methyl-3-nitroso-nitroguanidin (MNNG) | 50 mg.mL-1 (DMSO) | 10 μ g.mL-1 Zoll |
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1 L Filtereinheiten (PES, 0,22 μm Porengröße) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| 12 mm x 75 mm Rohr (Kappe mit zwei Positionen) (Polypropylen) | USA Wissenschaftlich | 1450-0810 | fasst 4 mL mit geringem Hohlraumvolumen (für Induktion) |
| 15 mL konische Zentrifugenröhrchen (Polypropylen) | USA Wissenschaftlich | 5618-8271 | |
| 1-Methyl-3-nitroso-nitroguanidin (MNNG) | Millipore Sigma | VORSICHT: potenziell krebserregend; nicht mehr ohne weiteres verfügbar, haben den angebotenen Ersatz nicht getestet | |
| 5,75" Pasteur-Pipetten (mit Baumwollstecker/Borosilikatglas/unsteril) | Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | Vor Gebrauch autoklavieren |
| Konische Zentrifugenröhrchen 50 mL (Polypropylen) | USA Wissenschaftlich | 1500-1211 | |
| Absolutes Ethanol | |||
| Bacto Neopepton | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolat | Gibco | 255772 | |
| Rinderserumalbumin (Serumersatzqualität) | Gemini Bio-Produkte | 700-104P | |
| CMRL-1066 ohne L-Glutamin (Pulver) | US Biologisch | Nr. C5900-01 | Zellkultur-Qualität |
| Erythromycin | Research Products International Corp | Nr. E57000-25.0 | |
| Gentamicin-Reagenzlösung | Gibco | 15750-060 | |
| Glukose (Dextrose wasserfrei) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | Nr. BP310-500 | |
| Kanamycinsulfat | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0,22 μM Porengröße) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | zum Filtrieren, Sterilisieren von Antibiotika und anderen kleinvolumigen Lösungen |
| Mitomycin C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | VORSICHT: potenziell krebserregend; Nur in einem chemischen Abzug verwenden |
| N-Acetyl-D-Glucosamin | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| Petrischale (100 mm × 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Kaninchenserum unsteril spurenhämolysiertes Jungtier (NRS) | Pel-Freez Biologika | 31119-3 | Hitzeinaktivierung gemäß den Anweisungen des Herstellers |
| Natriumbicarbonat | Thermo Fisher Scientific | Nr. BP328-500 | |
| Natriumpyruvat | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Streptomycinsulfat-Lösung | Millipore Sigma | Nr. S6501-50G | |
| Trinatriumcitrat-Dihydrat | Millipore Sigma | Nr. S1804-500G | Natriumcitrat für BSK |
