Nachweis eines Zielanalyten mit einem bakteriellen Biosensor

Zusammenfassung

Quelle: Barber, A. E., et al. Vorbereitung und Anwendung eines neuen bakteriellen Biosensors zur mutmaßlichen Detektion von Schussrückständen. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt die Detektion spezifischer Analyten mit Hilfe eines bakteriellen Biosensors. Es wird eine Bakterienkultur entnommen, die ein Plasmid mit einem Gen für rot fluoreszierendes Protein (RFP) unter einem analytsensitiven Promotor trägt. Nach dem gründlichen Abwischen der Testoberfläche wird ein kleiner Teil des Tuchs in die Kultur getaucht und inkubiert. Die Interaktion des Analyten mit dem Promotor aktiviert die RFP-Expression, was das Vorhandensein des Zielanalyten bestätigt.

Protokoll

HINWEIS: Die Synthese von E. coli , die rot fluoreszierendes Protein (RFP) exprimieren, wird vorgestellt.

1. Herstellung von Plasmid-Desoxyribonukleinsäure (DNA) aus E. coli

1. E.coli, die ein Plasmid mit einem RFP-Gen und einem Ampicillin-Resistenzgen enthalten, auftauen und die E.coli auf Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin in Luria-Bouillon (LB) bei 37 °C für 24 h züchten. Verwenden Sie z. B. das Plasmid J10060 aus dem Verzeichnis der biologischen Normteile, die für die synthetische Biologie verwendet werden (siehe Materialtabelle). Das J10060-Plasmid enthält ein Gen für RFP unter der Kontrolle einer pBad-Promotorregion und ein Ampicillin-Resistenzgen. Alternativ können E.coli (siehe Schritt 3.2) mit dem Plasmid transformiert werden, bevor sie auf den LB-Agarplatten wachsen.
2. Befolgen Sie ein Standard-Miniprep-Protokoll (siehe Materialtabelle), um DNA aus 1 ml einer E. coli-Kultur zu isolieren, die das J10060-Plasmid enthält. Der Zweck des folgenden Protokolls besteht darin, den pBad-Promotor zu entfernen und durch den gewünschten Promotor für das Gerät zu ersetzen.
3. Bewahren Sie die DNA nach der Plasmid-Miniprep im Gefrierschrank auf, bis sie für die Verdauung bereit ist.

2. Verdau von Restriktionsenzymen

1. Richten Sie die folgende Reaktion in einem Mikrozentrifugenröhrchen für den EcoRI- und NheI-Aufschluss ein: 10 μl J10060-Plasmid-DNA (isoliert in Schritt 1), 8 μl Wasser und je 1 μl EcoRI- und NheI-Enzyme, vorgemischt mit 1 μl Puffer (siehe Materialtabelle).
2. Für die Promotor-DNA wird die folgende Reaktion in einem Mikrozentrifugenröhrchen für den EcoRI- und NheI-Aufschluss eingeleitet: 10 μl geglühte Promotor-DNA-Sequenzen (8 μl Wasser und je 1 μl EcoRI- und NheI-Enzyme, vorgemischt mit 1 μl Puffer).
   1. Für Antimon (Sb-), Blei (Pb-) oder Trinitrotoluol (TNT)-RFP (siehe Materialtabelle) lösen Sie die Oligonukleotide in Puffer (30 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), pH 7,5; 100 mM Kaliumacetat), inkubieren Sie in gleichen molaren Konzentrationen, erhitzen Sie sie 2 min lang auf 94 °C und kühlen Sie sie allmählich bei Raumtemperatur ab).
3. Mischen Sie die Proben, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, wobei die Pipette auf 10 μl eingestellt ist.
4. 30 min bei 37 °C inkubieren.
5. Die Enzyme bei 80 °C für 5 min hitzeinaktivieren.
6. Bewahren Sie die verdaute DNA im Gefrierschrank auf, bis sie für den nächsten Schritt bereit ist.

3. Ligation und Transformation

1. Gebundenheit
   1. Unter Verwendung des Plasmids und der Promotor-DNA, die in Schritt 2 mit EcoRI und NheI doppelt verdaut wurden, wird das in Tabelle 1 gezeigte Reaktionsgemisch in einem Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis aufgebaut. Fügen Sie zuletzt die T4-DNA-Ligase hinzu. HINWEIS: Tabelle 1 zeigt eine Ligation mit einem molaren Verhältnis von 1:3 Vektor zum Insert für die angegebenen DNA-Größen.
   2. Mischen Sie die Reaktion vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren und kurz mikrozentrifugieren.
   3. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   4. Bei 65 °C für 10 Min. erhitzen.
2. Transformation
   1. Tauen Sie ein Röhrchen mit 20 μL DH5-alpha Competent E. coli Zellen auf Eis auf, bis die letzten Eiskristalle verschwunden sind.
   2. Geben Sie 5 μl Plasmid-DNA in die Zellmischung. Schnippen Sie vorsichtig 4-5 Mal vorsichtig mit dem Röhrchen, um die Zellen und die DNA zu vermischen.
   3. Die Mischung 2 min auf Eis legen.
   4. Hitzeschock bei genau 42 °C für genau 30 s. Nicht mischen.
   5. 2 Min. auf Eis legen. Nicht mischen.
   6. Pipettieren Sie 380 μl superoptimale Brühe bei Raumtemperatur mit Katabolitrepression (SOC) in die Mischung. Sofort auf eine LB-Agarplatte mit Ampicillin (100 μg/ml) geben und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
   7. Überprüfen Sie die Platten innerhalb von 24 h auf Wachstum.
   8. Verschließen Sie die Platten mit Siegelfolie und bewahren Sie sie bis zum nächsten Schritt im Kühlschrank auf.

4. Kolonie-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

1. In ein PCR-Röhrchen (4 Reaktionsröhrchen aufstellen) werden die in Tabelle 2 gezeigten Reaktionsgemische gegeben.
2. Mischen Sie die Reaktionen vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren.
3. Kratzen Sie mit einer gelben Pipettenspitze eine Kolonie (oder einen sehr kleinen Bereich) der transformierten E. coli ab. Übertragen Sie einen Wisch dieses E. coli auf eine neue, abgetrennte LB/Ampicillin/Agar-Platte und führen Sie dann die Pipettenspitze in das PCR-Röhrchen ein. Schütteln Sie die Pipettenspitze, um die E. coli mit der PCR-Mischung zu mischen. Wiederholen Sie dies noch dreimal für weitere Völker. Übertragen Sie die PCR-Röhrchen in ein PCR-Gerät und beginnen Sie mit dem Thermocycling mit dem in Tabelle 3 gezeigten Programm.
4. Führen Sie eine Gelelektrophorese mit einem 2%igen Agarosegel in TAE 9Tris-Acetat-EDTA durch, um zu bestimmen, welche Kolonien die beste Ligation in das Plasmid aufweisen, und züchten Sie diese Kolonien auf einer neuen Platte.
5. Bewahren Sie die Platten bis zum Testen im Kühlschrank auf. Bereiten Sie eine Flüssigkultur in Luria-Bouillon mit 100 μg/ml Ampicillin für chemische Tests vor.

5. DNA-Sequenzierung

1. Fügen Sie für jede Probe 5 μl Plasmid, 4 μl des Sequenzierungsprimers und 3 μl deionisiertes Wasser hinzu.
2. Geben Sie diese Mischung in ein Röhrchen und senden Sie es zur DNA-Sequenzierung (siehe Materialtabelle).
3. Analysieren Sie DNA-Sequenzdaten, um die erwarteten und beobachteten DNA-Sequenzen mit Hilfe einer DNA-Sequenzanalysesoftware zu vergleichen und sicherzustellen, dass keine Mutation vorliegt und die Gene korrekt eingefügt wurden.
   HINWEIS: Die Verwendung von E. coli als chemischer Sensor wird unten beschrieben.

6. Vorbereitung von E. coli-Kulturen

1. Bereiten Sie LB mit 100 μg/mL Ampicillin für Flüssigkulturen vor.
2. Bereiten Sie Flüssigkulturen der Sensorbakterien, der Positivkontrollbakterien* und der Negativkontrollbakterien** vor.
   ANMERKUNG: *Positivkontrollbakterien: E. coli , die ein Plasmid enthalten, bei dem das RFP-Gen von einem konstitutiven Promotor kontrolliert wird; In dieser Arbeit wurde das Plasmid E1010 aus dem Verzeichnis der für die synthetische Biologie verwendeten biologischen Standardteile (siehe Materialtabelle) verwendet.**Negative Kontrollbakterien: E. coli , die ein Plasmid mit dem RFP-Gen enthalten, das von einem anderen Promotor kontrolliert wird, wie z. B. dem pBad-Promotor (Plasmid J10060 aus dem Register der biologischen Standardteile, die für die synthetische Biologie verwendet werden (siehe Materialtabelle) oder ein Plasmid, das das RFP-Gen nicht hat.
3. Die Kulturen werden für mindestens 8 Stunden, maximal 18 Stunden in einen Schüttelinkubator bei 37 °C und 220 U/min gestellt. Trüber Brühe deutet auf Bakterienwachstum hin.

7. Titration von E. coli, um die Funktion des Geräts zu überprüfen

HINWEIS: Sobald die Sensoren titriert wurden, um die Funktion zu überprüfen, muss dieser Schritt nicht wiederholt werden. Eine Positivkontrolle in Form der Zugabe von Blei, Antimon und 2,4-DNT oder 1,3-Dinitrobenzol (1,3-DNB) kann die Funktion der Geräte für jede Verwendung überprüfen, ohne dass die volle Titration erforderlich ist.

1. Bereiten Sie eine Stammlösung des Analyten bzw. der Analyten in einer Konzentration von 10 ppm in Wasser vor. Wenn die Löslichkeit ein Problem darstellt, verwenden Sie ein 50/50-Wasser/Methanol-Gemisch.
2. Beschriften Sie anhand von Tabelle 4 die entsprechende Anzahl steriler Kulturröhrchen und geben Sie 2 ml der kultivierten Bouillon (aus Protokollschritt 6) in jedes Röhrchen.
   HINWEIS: Um einen allgemeinen Analysebereich zu bestimmen, werden mindestens drei verschiedene Stufen eines Analyten mit den Sensorbakterien, eine Stufe mit der Negativkontrolle und eine Stufe mit der Positivkontrolle durchgeführt. Es sollte auch ein Röhrchen von jedem der Bakterien geben, das kein zugesetztes Metall enthält (eine andere Art der Negativkontrolle). Um den Analysebereich und die Nachweisgrenzen genauer zu bestimmen, verwenden Sie einen größeren Bereich von Analytkonzentrationen.
3. Geben Sie Analyt-Stammlösung in die Röhrchen mit 2 ml Brühe, wie in Tabelle 4 angegeben, setzen Sie die Schnappkappen locker auf das Kulturröhrchen, damit sie locker sind (damit Luft in das Röhrchen eindringen kann), und wirbeln Sie das Kulturröhrchen ein.
4. Lassen Sie die Schnappverschlüsse locker auf den Kulturröhrchen und stellen Sie sie für mindestens 24 h bei 220 U/min und 37 °C in einen Schüttelinkubator.
5. Nehmen Sie die Röhrchen aus dem Inkubator, schnappen Sie die Kappen fest auf die Röhrchen und bewahren Sie die Röhrchen bis zur Fluoreszenzanalyse im Kühlschrank auf.

8. Verwendung von E. coli als chemischer Sensor für Schussrückstände (GSR)

1. Wischen Sie mit einem Tuch auf Ethanolbasis zur Entfernung von Blei (siehe Materialtabelle) alle Oberflächen der Hände ab, auch zwischen den Fingern. Verwenden Sie für jede Hand ein separates Tuch. Bewahren Sie die Tücher bis zur Analyse in einem entsprechend gekennzeichneten, verschließbaren Beutel auf.
2. Verwenden Sie für zu prüfende Oberflächen ein Tuch auf Alkoholbasis für große Flächen oder ein mit Ethanol angefeuchtetes Wattestäbchen für kleine Flächen.
   HINWEIS: Um die Reaktion der Sensoren auf GSR zu demonstrieren, wurde die Innenseite einer verbrauchten Patronenhülse des Kalibers .40 mit einem mit Ethanol angefeuchteten Wattestäbchen abgewischt.
3. Schneiden Sie mit sauberen Handschuhen und mit einer Schere, die mit Alkohol gereinigt wurde, ein ca. 1 cm² breites Stück aus der Mitte des Tuchs heraus.
4. Legen Sie das abgeschnittene Stück des Handtuchs oder des Wattestäbchens direkt in ein Kulturröhrchen, das 2 ml der Sensorbakterien enthält, und stellen Sie sicher, dass es in die Brühe eingetaucht ist.
5. Gehen Sie wie oben in den Schritten 7.4 – 7.5 beschrieben vor.

Tabelle 1. Reaktionsgemisch für die Ligation, Protokollschritt 3.1.1.

BESTANDTEIL	20 μL REAKTION
10X T4 DNA-Ligase-Puffer	2 μL
Plasmid-DNA (3 kb)	3 μL
Promotor-DNA (0.7kb)	10 μL
Nukleasefreies Wasser	4 μL
T4-DNA-Ligase	1 μL

 

 

 

 

 

 

Tabelle 2. Reaktionsgemische für die Kolonie-PCR, Protokollschritt 4.1.

Bestandteil	25 μL Reaktion
10 μM Vorwärts-Primer	0,5 μl
10 μM Reverse Primer	0,5 μl
EinTaq 2X Mastermix	12,5 μl
Nukleasefreies Wasser	11 μL

 

 

 

 

 

Tabelle 3. PCR-Thermocycling-Parameter für Protokollschritt 4.3.

SCHRITT	AUSHILFE	ZEIT
Anfängliche Denaturierung	94 °C	30 Sek.
30 Zyklen	94 °C	30 Sek.
	55 °C	45 Sek.
	68 °C	60 Sek.
Letzte Verlängerung	68 °C	5 Minuten
Halten	4 °C

 

 

 

 

 

 

 

Tabelle 4. Allgemeiner Versuchsaufbau zur Titration von Biosensoren, Protokollschritt 7.2.

Rohr-ID	Bakterien	Konzentration der zugesetzten Analytlösung (ppm)	Metall hinzugefügt	Volumen der Analytlösung, die zu 2.000 μl Bouillon hinzugefügt wurde	[Analyt], ppb
1	PbRFP (Englisch)	10	Pb	2.5	12
2	PbRFP (Englisch)	10	Pb	75	361
3	PbRFP (Englisch)	10	Pb	150	698
4	PbRFP (Englisch)	0	nichts	0	0
5	RFP neg	10	Pb	10	50
6	Ausschreibung pos	10	Pb	10	50

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