Schwarm-Assay zur Visualisierung der bakteriellen Oberflächenmotilität

Zusammenfassung

Quelle: Morales-Soto, N. et. al., Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt einen Schwarm-Assay mit Bakterien, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren, um die Oberflächenmotilität auf weichem Agar zu beobachten. Die Zeitraffer-Bildgebung erfasst die koordinierte Expansion und Rankenbildung und hebt die bakterielle Oberflächenmotilität hervor.

Protokoll

1. Vorbereitung und Inokulation von Schwarm-Assay-Medien

1. Vorbereitung der Medien
   ANMERKUNG: Die unten beschriebene Zusammensetzung des Mediums ist auf Studien zur Rankenbildung von Pseudomonas aeruginosa anwendbar. Bitte beachten Sie die Medienspezifikationen in Tabelle 1 für Oberflächenmotilitätsassays für Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis und Myxococcus xanthus .
   1. Mischen Sie 200 ml fluidisierten aeroben Bioreaktor (FAB)-minus Ammoniumsulfat ((NH4)₂SO₄)-Schwarmmedium (Materialtabelle), 0,9 g Noble-Agar und 0,2 g Casaminosäuren (Tabelle 1) durch Rühren mit einem magnetischen Rührstab. Verwenden Sie kleine Volumina (100-300 ml), um die Konsistenz zwischen den Experimenten zu verbessern.
   2. Autoklavieren Sie das 200-ml-Agar/Medien-Gemisch mit einer Belichtungszeit von 22 Minuten, einer Expositionstemperatur von 121,1 °C und einer Schnellentlüftungsoption. Die Autoklaveneinstellungen ermöglichen eine ordnungsgemäße Sterilisation und das Schmelzen des Agars, verhindern jedoch die Karamellisierung des Agars.
      ANMERKUNG: Edel-Agar neigt zur Karamellisierung; Die bakterielle Beweglichkeit wird auf karamellisiertem Agar verändert.
   3. Schließen Sie unmittelbar nach Abschluss des Sterilisationszyklus den Deckel der Medienflasche, um Wasserverlust durch Verdunstung zu verhindern. Beachten Sie jedoch, dass ein dichtes Verschließen einen "vakuumversiegelnden" Effekt auf der Flasche verursachen kann.
   4. Kühlen Sie das Medium unter Rühren bei Raumtemperatur (RT) auf 50 °C ab und fügen Sie 2 ml sterile 1,2 M Glukose hinzu. Alternativ können Sie das Medium bis zur Verwendung (bis zu 15 Stunden später) in einen 60 °C heißen Inkubator oder ein Wasserbad legen und wie angegeben fortfahren. Um die Bildung von Blasen im Medium zu verhindern, mischen Sie es gründlich mit dem magnetischen Rührstab; Blasen auf der Oberfläche des Agars verhindern ein gleichmäßiges Schwärmen.
      ANMERKUNG: Bei anderen Assays fügen Sie in diesem Schritt bei Bedarf wärmeempfindliche Komponenten hinzu, die nicht autoklaviert werden können, wie z. B. zusätzliche Nährstoffe oder Farbstoffe (z. B. 8 μl Invitrogen Syto 63 Farbstoff pro 100 ml geschmolzenem Agar, um M. xanthus abzubilden, wie in den repräsentativen Ergebnissen unten gezeigt). Die Zugabe einiger Farbstoffe kann das Schwarmverhalten der Grundlinie beeinflussen, was mit einer Nicht-Farbstoffkontrolle verglichen werden sollte.
   5. Aliquotieren Sie in einer Laborhaube 7,5 ml sterile Medien pro Polystyrol-Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm und halten Sie die Platten in einer einzigen Schicht (nicht gestapelt). Für eine größere Schwarmfläche aliquotieren Sie 25 ml Medium pro Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm. Es ist wichtig, das Geschirr auf einer ebenen horizontalen Fläche zu füllen. Verwenden Sie eine Bullaugenhöhe, um zu überprüfen, ob die Oberfläche nivelliert ist.
      ANMERKUNG: Bei P. aeruginosa-Assays verbessert die Verwendung eines spezifischen Medienvolumens pro Platte die Konsistenz und Reproduzierbarkeit. Für B . subtilis - und M. xanthus-Assays liefert das manuelle Gießen Ergebnisse, die mit Aliquoten mit spezifischem Volumen vergleichbar sind.
2. Aushärtung von Platten
   1. Bei kleinen Platten (60 mm) lassen Sie das geschmolzene Agarmedium (sowohl auf halbfeste als auch auf trockene überschüssige Flüssigkeit) in der Haube unbedeckt (d. h. ohne Deckel) 30 Minuten lang aushärten. Größere Platten (100 mm) benötigen eine längere Aushärtungszeit (siehe Diskussion).
      ANMERKUNG: Alternativ können einige Assays erfordern, dass die Platten über Nacht (20-24 Stunden) auf dem Labortisch in einer einzigen Schicht aushärten (d. h. mit Deckeln auf) (Tabelle 1). Schwärmen reagiert empfindlich sowohl auf überschüssige als auch auf unzureichende Feuchtigkeit. Die Luftfeuchtigkeit, der Luftstrom und die Temperatur eines bestimmten Labors können eine Variation der Plattenhärtung erforderlich machen, um ein optimales Schwärmen Ihres Bakteriums zu fördern.
   2. Beimpfen Sie die Platten unmittelbar nach Beendigung der Trocknungsphase. Lagern Sie die Platten nicht für die weitere Verwendung.
      1. Führen Sie den "Tintenverteilungstest" durch, indem Sie eine Testplatte mit einer 10-μl-Mischung aus 0,50 % (vol/vol) Higgins wasserfester schwarzer Tusche und bakteriellem Inokulum punktuieren. Wenn sich das Tinten-Inokulum-Gemisch leicht auf der Oberfläche des Mediums ausbreitet (d. h . keine Tröpfchenform beibehält), benötigt das Medium zusätzliche Zeit zum Trocknen.
         ANMERKUNG: Bei Spezies, die besonders empfindlich auf Feuchtigkeit reagieren (z. B. P. aeruginosa), führen Sie einen schnellen "Farbverteilungstest" durch, um festzustellen, ob die Platten trocken genug sind.
3. Swarm-Assay-Inokulation
   1. Beimpfen Sie 6 ml Bouillon-Nährmedien (siehe Tabelle 1 für Details) mit einer isolierten Kolonie aus einer frischen (< 5 Tage alt, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert wird) Lysogeny Broth (LB) Plattenkultur. Inkubieren Sie die Bouillonkulturen über Nacht (≤18 Stunden) bei 30 °C oder 37 °C unter horizontalem Schütteln (240 U/min).
   2. Beimpfen Sie die Schwarmplatten, indem Sie sie mit 1-5 μl Nachtbrühe aufklären oder indem Sie den Agar mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Drahtinokulationsnadel "anstechen".
      ANMERKUNG: Wir bevorzugen die letztere Methode, da sie die Wahrscheinlichkeit von Spritzern des Inokulums verringert und verhindert, dass der Schwarmoberfläche zusätzliche Feuchtigkeit zugeführt wird.
4. Schwarm-Assay-Inkubation
   1. Für einen allgemeinen Assay inkubieren Sie die Schwarm-Assay-Platten bei 30 °C oder 37 °C (oder sogar 42 °C für B. subtilis; Tabelle 1) – dies ist bakterienspezifisch. Drehen Sie die Platten während der Inkubation um, so dass überschüssige Feuchtigkeit auf dem Deckel und nicht auf dem Agar kondensiert.
      ANMERKUNG: Die Temperatur kann den Phänotyp und die Kinetik beeinflussen. Bei P. aeruginosa-Schwärmen führt die Inkubation bei 37 °C zu einem schnelleren Wachstum und einer schnelleren Schwarmausdehnung als eine Inkubation bei 30 °C; Die Morphologie dieser Schwärme unterscheidet sich jedoch oft mit dieser Temperaturänderung.
   2. Für die Zeitraffer-Bildgebung inkubieren Sie die Schwarmplatten bei der entsprechenden Temperatur, bevor Sie sie in die Bildgebungsstation übertragen (siehe Tabelle 1 für Details).
      ANMERKUNG: Diese Inkubation vor der Bildgebung ermöglicht es den Schwärmen, ihre Entwicklung zu beginnen und sich zu etablieren, bevor sie in eine neue Umgebung gebracht werden, die für die Motilität des Schwärmens optimal sein kann oder auch nicht.

2. Makroskopische Bildgebung von Oberflächenmotilitätsassays

1. Für die Zeitraffer-Bildgebung platzieren Sie die Schwarm-Assay-Platten nach der Inkubationszeit vor der Bildgebung auf einer transparenten Speicherfolie in einer kommerziellen In-vivo-Bildgebungsstation . Bilde bis zu sechs Platten mit einem Durchmesser von 60 mm oder vier Platten mit einem Durchmesser von 100 mm gleichzeitig ab. Da die Kamera Bilder unter der Bildebene aufnimmt, drehen Sie die Platten um, damit der Strahlengang nicht behindert wird. Alternativ können Sie für die Dauer des Experiments bei 30 °C oder 37 °C (Tabelle 1) inkubieren und die abzubildenden Platten in festgelegten Zeitabständen aus dem Inkubator nehmen.
2. Legen Sie die Deckel der Petrischalen aufrecht auf das Plattengegenstück, das das inokulierte Medium hält. Füllen Sie die Deckel der Petrischalen mit Wasser, um ein übermäßiges Austrocknen während der Bildgebung zu verhindern, und umschließen Sie den gesamten Aufbau mit einer weiteren durchsichtigen Schale, um die Feuchtigkeit während des gesamten Experiments aufrechtzuerhalten.
3. Führen Sie mit der Molecular Imaging (MI)-Software Assays bei Raumtemperatur mit den in Tabelle 2 beschriebenen Bildgebungseinstellungen durch. Richten Sie für die Zeitraffer-Bildgebung ein Protokoll mit den erforderlichen Schritten und Spezifikationen ein.

Tabelle 1: Spezifikationen für die Vorbereitung von Oberflächenmotilitätsassays. Enthält Spezifikationen für die Vorbereitung von Oberflächenmotilitätsassays für P. aeruginosa, B. subtilis und M. xanthus.

	P. aeruginosa	Studien zur Rankenbildung von P. aeruginosa	B. subtilis	M. xanthus
Nährmedien für die Brühe über Nacht	FAB plus 30 mM Glukose	FAB plus 30 mM Glukose	PFUND	CTT (komplexe Medien)
Inkubationstemperatur der Bouillonkultur über Nacht	37 °C	37 °C	37 °C	30 Std. bei 30 °C
Schwarm-Medien	FAB	FAB minus (NH4)2SO4	2% (wt/vol) LB	CTT
Schwarmmedien: zusätzliche Komponenten	12 mM Glukosea	10% (wt/vol) Casaminosäuren (CAA), 12 mM Glukosea	n/a	SYTO® 64a
Agar-Typ	Agar, edel	Agar, edel	Granulierter Agar	Agar, Edle Affymetrix
Agar-Konzentration (wt/vol)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
Größe der Schwarmplatte	60 mm	60 mm	ca. 100 mm	ca. 150 mm
Medienvolumen pro Platte	7,5 ml	7,5 ml	Handgegossen	Handgegossen
Einstellung des Schwarmmediums/Trocknungsmethode	Haube; Platten unbedeckt	Haube; Platten unbedeckt	Tischplatten abgedeckt	Tischplatten abgedeckt
Einstellung des Schwarmmediums/Trocknungszeit	30 Minuten	30 Minuten	Übernachtung (20 -24 Stunden)	Übernachtung (20 -24 Stunden)
Inkubationstemperatur des Schwarmassays	30 oder 37 °C	30 °C	37 °C	30 °C
Inkubation für Zeitraffer-Imaging	30 °C für mind. 4 Std.	30 °C für mind. 4 Std.	37 °C für 2 Stunden	RT für 12 Stunden
Länge der Zeitrafferaufnahme	24 Stunden	24 Stunden	10 Std.	66 Std.
Einstellung des Zeitraffers	1 Bild/10 min	1 Bild/10 min	1 Bild/6 Minuten	1 Bild/10 min
a Nach dem Autoklavieren hinzugefügt.

 

Tabelle 2: Bildgebungsspezifikation. Spezifikationen der Bruker-Bildgebungsstation für die Bildgebung von roter und grüner Fluoreszenz und Lumineszenz des bakteriellen Oberflächenwachstums.

Signal	Grüne Fluoreszenz	Rote Fluoreszenz I	Rote Fluoreszenz II	Lumineszenz
Protein oder Farbstoff	Grün fluoreszierendes Protein (GFP)	mKirschprotein- oder Nilrot-Rhamnolipid-Färbung	SYTO® 64	Luziferase aus dem Lux-Operon
Anregungswellenlänge (nm)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	Aus
Emissionswellenlänge (nm)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	Kein Filter
Belichtungszeit (sec)	30	60	60	240
Blende	4.0	4.0	2.5	1.1
Sichtfeld (mm)	190	190	140	120
Fokusebene (mm)	27.5	27.5	12.2	4
Binning (Pixel)	Nichts	2 x 2 Stück	Nichts	8 x 8 cm

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien:
FAB minimal Medien:				Alle ~4 Wochen vorbereiten. Auffüllen auf 1 L mit nanoreinem H2O.
(NH4)arabische ZifferSO4	Sigma	Nr. A4418	2 g	Nicht verwendet in Studien zur Rankenbildung von P. aeruginosa .
Na2HPO4 x 7H2O	Sigma-Aldrich	Nr. S9390	9 g
KH2PO4	Sigma	Nr. P5655	3 g
NaCl	BDH	BDH8014	3 g
MgCl2 x 6H2O Lösung (198 g/L)	Fisher Scientific	M33	1 ml
CaCl2 x 2H2O Lösung (14 g/L)	Fisher Scientific	Nr. C79	1 ml
Spurenmetalllösung (siehe unten)	n/a	n/a	1 ml
Spurenmetall-Lösung:				Mit nanopure H2O auf 1 L auffüllen. In einer Glasflasche unter Rühren aufbewahren und mit Folie abdecken.
CaSO4 x 2H2Ω	Sigma-Aldrich	255548	200 mg
MnSO4 x H2O	Sigma-Aldrich	M7634	20 mg
CuSO4 x 5H2Ω	Fisher Scientific	Nr. C493	20 mg
ZnSO4 x 7H2Ω	Sigma-Aldrich	Z4750	20 mg
CoSO4 x 7H2Ω	Sigma-Aldrich	Nr. C6768	10 mg
NaMoO4 x 2H2Ω	Sigma	Nr. S6646	10 mg
H3BO3	Fisher Scientific	Nr. A74	5 mg
FeSO4 x 7H2Ω	Sigma-Aldrich	Nr. F7002	200 mg
CTT-Medien:				Bereiten Sie sich nach Bedarf vor. Auffüllen auf 100 ml mit nanoreinem H2O.
Tris-HCl, 1 M Lösung (einstellbar auf pH 8,0)	Amresco	234	1 ml	Bereiten Sie eine 1 M Stammlösung in nanoreinem H2O vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 ein und sterilisieren Sie den Filter (0,2 μm Pore).
K2HPO4,1 M Lösung (auf pH 7,6 einstellen)	Sigma-Aldrich	Nr. P3786	0,1 ml	Bereiten Sie eine 1 M Stammlösung in nanoreinem H2O vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 ein und sterilisieren Sie den Filter (0,2 μm Pore).
MgSO4-Lösung	Fisher Scientific	M65	0,8 ml	Bereiten Sie eine 1 M Stammlösung in nanoreinem H2O vor. Filter sterilisieren (0,2 μm Pore).
Casitone	BD-Diagnose	225930	1 g
Zusätzliche Reagenzien:
LB Brühe, Lennox	BD-Diagnose	240230	2 % (Gew./Vol.)
D-(+)-Glukose	Sigma-Aldrich	Nr. G5767	30 mM für Bouillonkulturen über Nacht; 12 mM für Schwarmmedien	Bereiten Sie eine sterilisierte Stammlösung mit 1,2 M Filter in nanoreinem H2O vor. Nach dem Autoklavieren dem Medium zugeben.
Casaminosäuren (CAA)	Amresco	Nr. J851	0,10 % (Gew./Vol.)	Empfohlen für Studien zur Rankenbildung von P. aeruginosa . Vor dem Autoklavieren zu Medien hinzufügen.
Agar, edel	Sigma-Aldrich	Nr. A5431	0,45 % (Gew./Vol.)	Bevorzugter Noble-Agar für Untersuchungen der Oberflächenmotilität von P. aeruginosa . Vor dem Autoklavieren zu Medien hinzufügen.
Agar, edel	Affymetrix	10907	1,50 % (Gew./Vol.)	Wird in Studien zur Oberflächenmotilität von M. xanthus verwendet. Nicht empfohlen für Studien zur Motilität von P. aeruginosa . Vor dem Autoklavieren zu Medien hinzufügen.
Agar, granuliert	Fisher Scientific	Nr. BP1423	0,60 % (Gew./Vol.)
Higgins wasserfeste schwarze Tusche	Higgins	HIG44201	0,50 % (vol/vol)	Mischen Sie die Tinte mit dem Inokulum, um die Oberflächenfeuchtigkeit des Schwarmmediums zu testen.
SYTO® 64 rot fluoreszierender Nukleinsäure-Farbstoff	Invitrogen	Nr. S-11346		Verwenden Sie 4 μl (für P. aeruginosa) oder 8 μl (für M. xanthus) SYTO® 64 pro 100 ml geschmolzenen Agar (nach dem Autoklavieren zugegeben).
Relevante Materialien und Ausrüstungen:
Petrischale, steril, 150 mm x 15 mm (Ø x H)	VWR	25384-326
Petrischale, steril, 100 mm x 15 mm (Ø x H)	VWR	25384-342
Petrischale, steril, 60 mm x 15 mm (Ø x H)	VWR	25384-092
In-Vivo Xtream	Bruker			Verwendung für die makroskopische Bildgebung von Untersuchungen der Oberflächenmotilität. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html