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Schwarm-Assay zur Visualisierung der bakteriellen Oberflächenmotilität

26. September 2025

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Quelle: Morales-Soto, N. et. al., Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (2015)

Dieses Video zeigt einen Schwarm-Assay mit Bakterien, die grün fluoreszierendes Protein exprimieren, um die Oberflächenmotilität auf weichem Agar zu beobachten. Die Zeitraffer-Bildgebung erfasst die koordinierte Expansion und Rankenbildung und hebt die bakterielle Oberflächenmotilität hervor.

Protokoll

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1. Vorbereitung und Inokulation von Schwarm-Assay-Medien

  1. Vorbereitung der Medien
    ANMERKUNG: Die unten beschriebene Zusammensetzung des Mediums ist auf Studien zur Rankenbildung von Pseudomonas aeruginosa anwendbar. Bitte beachten Sie die Medienspezifikationen in Tabelle 1 für Oberflächenmotilitätsassays für Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis und Myxococcus xanthus .
    1. Mischen Sie 200 ml fluidisierten aeroben Bioreaktor (FAB)-minus Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4)-Schwarmmedium (Materialtabelle), 0,9 g Noble-Agar und 0,2 g Casaminosäuren (Tabelle 1) durch Rühren mit einem magnetischen Rührstab. Verwenden Sie kleine Volumina (100-300 ml), um die Konsistenz zwischen den Experimenten zu verbessern.
    2. Autoklavieren Sie das 200-ml-Agar/Medien-Gemisch mit einer Belichtungszeit von 22 Minuten, einer Expositionstemperatur von 121,1 °C und einer Schnellentlüftungsoption. Die Autoklaveneinstellungen ermöglichen eine ordnungsgemäße Sterilisation und das Schmelzen des Agars, verhindern jedoch die Karamellisierung des Agars.
      ANMERKUNG: Edel-Agar neigt zur Karamellisierung; Die bakterielle Beweglichkeit wird auf karamellisiertem Agar verändert.
    3. Schließen Sie unmittelbar nach Abschluss des Sterilisationszyklus den Deckel der Medienflasche, um Wasserverlust durch Verdunstung zu verhindern. Beachten Sie jedoch, dass ein dichtes Verschließen einen "vakuumversiegelnden" Effekt auf der Flasche verursachen kann.
    4. Kühlen Sie das Medium unter Rühren bei Raumtemperatur (RT) auf 50 °C ab und fügen Sie 2 ml sterile 1,2 M Glukose hinzu. Alternativ können Sie das Medium bis zur Verwendung (bis zu 15 Stunden später) in einen 60 °C heißen Inkubator oder ein Wasserbad legen und wie angegeben fortfahren. Um die Bildung von Blasen im Medium zu verhindern, mischen Sie es gründlich mit dem magnetischen Rührstab; Blasen auf der Oberfläche des Agars verhindern ein gleichmäßiges Schwärmen.
      ANMERKUNG: Bei anderen Assays fügen Sie in diesem Schritt bei Bedarf wärmeempfindliche Komponenten hinzu, die nicht autoklaviert werden können, wie z. B. zusätzliche Nährstoffe oder Farbstoffe (z. B. 8 μl Invitrogen Syto 63 Farbstoff pro 100 ml geschmolzenem Agar, um M. xanthus abzubilden, wie in den repräsentativen Ergebnissen unten gezeigt). Die Zugabe einiger Farbstoffe kann das Schwarmverhalten der Grundlinie beeinflussen, was mit einer Nicht-Farbstoffkontrolle verglichen werden sollte.
    5. Aliquotieren Sie in einer Laborhaube 7,5 ml sterile Medien pro Polystyrol-Petrischale mit einem Durchmesser von 60 mm und halten Sie die Platten in einer einzigen Schicht (nicht gestapelt). Für eine größere Schwarmfläche aliquotieren Sie 25 ml Medium pro Petrischale mit einem Durchmesser von 100 mm. Es ist wichtig, das Geschirr auf einer ebenen horizontalen Fläche zu füllen. Verwenden Sie eine Bullaugenhöhe, um zu überprüfen, ob die Oberfläche nivelliert ist.
      ANMERKUNG: Bei P. aeruginosa-Assays verbessert die Verwendung eines spezifischen Medienvolumens pro Platte die Konsistenz und Reproduzierbarkeit. Für B . subtilis - und M. xanthus-Assays liefert das manuelle Gießen Ergebnisse, die mit Aliquoten mit spezifischem Volumen vergleichbar sind.
  2. Aushärtung von Platten
    1. Bei kleinen Platten (60 mm) lassen Sie das geschmolzene Agarmedium (sowohl auf halbfeste als auch auf trockene überschüssige Flüssigkeit) in der Haube unbedeckt (d. h. ohne Deckel) 30 Minuten lang aushärten. Größere Platten (100 mm) benötigen eine längere Aushärtungszeit (siehe Diskussion).
      ANMERKUNG: Alternativ können einige Assays erfordern, dass die Platten über Nacht (20-24 Stunden) auf dem Labortisch in einer einzigen Schicht aushärten (d. h. mit Deckeln auf) (Tabelle 1). Schwärmen reagiert empfindlich sowohl auf überschüssige als auch auf unzureichende Feuchtigkeit. Die Luftfeuchtigkeit, der Luftstrom und die Temperatur eines bestimmten Labors können eine Variation der Plattenhärtung erforderlich machen, um ein optimales Schwärmen Ihres Bakteriums zu fördern.
    2. Beimpfen Sie die Platten unmittelbar nach Beendigung der Trocknungsphase. Lagern Sie die Platten nicht für die weitere Verwendung.
      1. Führen Sie den "Tintenverteilungstest" durch, indem Sie eine Testplatte mit einer 10-μl-Mischung aus 0,50 % (vol/vol) Higgins wasserfester schwarzer Tusche und bakteriellem Inokulum punktuieren. Wenn sich das Tinten-Inokulum-Gemisch leicht auf der Oberfläche des Mediums ausbreitet (d. h . keine Tröpfchenform beibehält), benötigt das Medium zusätzliche Zeit zum Trocknen.
        ANMERKUNG: Bei Spezies, die besonders empfindlich auf Feuchtigkeit reagieren (z. B. P. aeruginosa), führen Sie einen schnellen "Farbverteilungstest" durch, um festzustellen, ob die Platten trocken genug sind.
  3. Swarm-Assay-Inokulation
    1. Beimpfen Sie 6 ml Bouillon-Nährmedien (siehe Tabelle 1 für Details) mit einer isolierten Kolonie aus einer frischen (< 5 Tage alt, wenn sie bei Raumtemperatur gelagert wird) Lysogeny Broth (LB) Plattenkultur. Inkubieren Sie die Bouillonkulturen über Nacht (≤18 Stunden) bei 30 °C oder 37 °C unter horizontalem Schütteln (240 U/min).
    2. Beimpfen Sie die Schwarmplatten, indem Sie sie mit 1-5 μl Nachtbrühe aufklären oder indem Sie den Agar mit einem sterilen Zahnstocher oder einer Drahtinokulationsnadel "anstechen".
      ANMERKUNG: Wir bevorzugen die letztere Methode, da sie die Wahrscheinlichkeit von Spritzern des Inokulums verringert und verhindert, dass der Schwarmoberfläche zusätzliche Feuchtigkeit zugeführt wird.
  4. Schwarm-Assay-Inkubation
    1. Für einen allgemeinen Assay inkubieren Sie die Schwarm-Assay-Platten bei 30 °C oder 37 °C (oder sogar 42 °C für B. subtilis; Tabelle 1) – dies ist bakterienspezifisch. Drehen Sie die Platten während der Inkubation um, so dass überschüssige Feuchtigkeit auf dem Deckel und nicht auf dem Agar kondensiert.
      ANMERKUNG: Die Temperatur kann den Phänotyp und die Kinetik beeinflussen. Bei P. aeruginosa-Schwärmen führt die Inkubation bei 37 °C zu einem schnelleren Wachstum und einer schnelleren Schwarmausdehnung als eine Inkubation bei 30 °C; Die Morphologie dieser Schwärme unterscheidet sich jedoch oft mit dieser Temperaturänderung.
    2. Für die Zeitraffer-Bildgebung inkubieren Sie die Schwarmplatten bei der entsprechenden Temperatur, bevor Sie sie in die Bildgebungsstation übertragen (siehe Tabelle 1 für Details).
      ANMERKUNG: Diese Inkubation vor der Bildgebung ermöglicht es den Schwärmen, ihre Entwicklung zu beginnen und sich zu etablieren, bevor sie in eine neue Umgebung gebracht werden, die für die Motilität des Schwärmens optimal sein kann oder auch nicht.

2. Makroskopische Bildgebung von Oberflächenmotilitätsassays

  1. Für die Zeitraffer-Bildgebung platzieren Sie die Schwarm-Assay-Platten nach der Inkubationszeit vor der Bildgebung auf einer transparenten Speicherfolie in einer kommerziellen In-vivo-Bildgebungsstation . Bilde bis zu sechs Platten mit einem Durchmesser von 60 mm oder vier Platten mit einem Durchmesser von 100 mm gleichzeitig ab. Da die Kamera Bilder unter der Bildebene aufnimmt, drehen Sie die Platten um, damit der Strahlengang nicht behindert wird. Alternativ können Sie für die Dauer des Experiments bei 30 °C oder 37 °C (Tabelle 1) inkubieren und die abzubildenden Platten in festgelegten Zeitabständen aus dem Inkubator nehmen.
  2. Legen Sie die Deckel der Petrischalen aufrecht auf das Plattengegenstück, das das inokulierte Medium hält. Füllen Sie die Deckel der Petrischalen mit Wasser, um ein übermäßiges Austrocknen während der Bildgebung zu verhindern, und umschließen Sie den gesamten Aufbau mit einer weiteren durchsichtigen Schale, um die Feuchtigkeit während des gesamten Experiments aufrechtzuerhalten.
  3. Führen Sie mit der Molecular Imaging (MI)-Software Assays bei Raumtemperatur mit den in Tabelle 2 beschriebenen Bildgebungseinstellungen durch. Richten Sie für die Zeitraffer-Bildgebung ein Protokoll mit den erforderlichen Schritten und Spezifikationen ein.

Tabelle 1: Spezifikationen für die Vorbereitung von Oberflächenmotilitätsassays. Enthält Spezifikationen für die Vorbereitung von Oberflächenmotilitätsassays für P. aeruginosa, B. subtilis und M. xanthus.

 P. aeruginosa Studien zur Rankenbildung von P. aeruginosaB. subtilisM. xanthus
Nährmedien für die Brühe über NachtFAB plus 30 mM GlukoseFAB plus 30 mM GlukosePFUNDCTT (komplexe Medien)
Inkubationstemperatur der Bouillonkultur über Nacht37 °C37 °C37 °C30 Std. bei 30 °C
Schwarm-MedienFABFAB minus (NH4)2SO42% (wt/vol) LBCTT
Schwarmmedien: zusätzliche Komponenten12 mM Glukosea10% (wt/vol) Casaminosäuren (CAA), 12 mM Glukosean/aSYTO® 64a
Agar-TypAgar, edelAgar, edelGranulierter AgarAgar, Edle Affymetrix
Agar-Konzentration (wt/vol)0.45%0.45%0.60%1.50%
Größe der Schwarmplatte60 mm60 mmca. 100 mmca. 150 mm
Medienvolumen pro Platte7,5 ml7,5 mlHandgegossenHandgegossen
Einstellung des Schwarmmediums/TrocknungsmethodeHaube; Platten unbedecktHaube; Platten unbedecktTischplatten abgedecktTischplatten abgedeckt
Einstellung des Schwarmmediums/Trocknungszeit30 Minuten30 MinutenÜbernachtung (20 -24 Stunden)Übernachtung (20 -24 Stunden)
Inkubationstemperatur des Schwarmassays30 oder 37 °C30 °C37 °C30 °C
Inkubation für Zeitraffer-Imaging30 °C für mind. 4 Std.30 °C für mind. 4 Std.37 °C für 2 StundenRT für 12 Stunden
Länge der Zeitrafferaufnahme24 Stunden24 Stunden10 Std.66 Std.
Einstellung des Zeitraffers1 Bild/10 min1 Bild/10 min1 Bild/6 Minuten1 Bild/10 min
a Nach dem Autoklavieren hinzugefügt.  

 

Tabelle 2: Bildgebungsspezifikation. Spezifikationen der Bruker-Bildgebungsstation für die Bildgebung von roter und grüner Fluoreszenz und Lumineszenz des bakteriellen Oberflächenwachstums.

SignalGrüne FluoreszenzRote Fluoreszenz IRote Fluoreszenz IILumineszenz
Protein oder FarbstoffGrün fluoreszierendes Protein (GFP)mKirschprotein- oder Nilrot-Rhamnolipid-FärbungSYTO® 64Luziferase aus dem Lux-Operon
Anregungswellenlänge (nm)480 ± 10540 ± 10590 ± 10Aus
Emissionswellenlänge (nm)535 ± 17.5600 ± 17.5670 ± 17.5Kein Filter
Belichtungszeit (sec)306060240
Blende4.04.02.51.1
Sichtfeld (mm)190190140120
Fokusebene (mm)27.527.512.24
Binning (Pixel)Nichts2 x 2 StückNichts8 x 8 cm

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien:    
FAB minimal Medien:   Alle ~4 Wochen vorbereiten. Auffüllen auf 1 L mit nanoreinem H2O.
(NH4)arabische ZifferSO4SigmaNr. A44182 gNicht verwendet in Studien zur Rankenbildung von P. aeruginosa .
Na2HPO4 x 7H2OSigma-AldrichNr. S93909 g 
KH2PO4SigmaNr. P56553 g 
NaClBDHBDH80143 g 
MgCl2 x 6H2O Lösung (198 g/L)Fisher ScientificM331 ml 
CaCl2 x 2H2O Lösung (14 g/L)Fisher ScientificNr. C791 ml 
Spurenmetalllösung (siehe unten)n/an/a1 ml 
     
Spurenmetall-Lösung:   Mit nanopure H2O auf 1 L auffüllen. In einer Glasflasche unter Rühren aufbewahren und mit Folie abdecken.
CaSO4 x 2H2ΩSigma-Aldrich255548200 mg 
MnSO4 x H2OSigma-AldrichM763420 mg 
CuSO4 x 5H2ΩFisher ScientificNr. C49320 mg 
ZnSO4 x 7H2ΩSigma-AldrichZ475020 mg 
CoSO4 x 7H2ΩSigma-AldrichNr. C676810 mg 
NaMoO4 x 2H2ΩSigmaNr. S664610 mg 
H3BO3Fisher ScientificNr. A745 mg 
FeSO4 x 7H2ΩSigma-AldrichNr. F7002200 mg 
     
CTT-Medien:   Bereiten Sie sich nach Bedarf vor. Auffüllen auf 100 ml mit nanoreinem H2O.
Tris-HCl, 1 M Lösung (einstellbar auf pH 8,0)Amresco2341 mlBereiten Sie eine 1 M Stammlösung in nanoreinem H2O vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,0 ein und sterilisieren Sie den Filter (0,2 μm Pore).
K2HPO4,1 M Lösung (auf pH 7,6 einstellen)Sigma-AldrichNr. P37860,1 mlBereiten Sie eine 1 M Stammlösung in nanoreinem H2O vor. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,6 ein und sterilisieren Sie den Filter (0,2 μm Pore).
MgSO4-LösungFisher ScientificM650,8 mlBereiten Sie eine 1 M Stammlösung in nanoreinem H2O vor. Filter sterilisieren (0,2 μm Pore).
CasitoneBD-Diagnose2259301 g 
     
Zusätzliche Reagenzien:    
LB Brühe, LennoxBD-Diagnose2402302 % (Gew./Vol.) 
D-(+)-GlukoseSigma-AldrichNr. G576730 mM für Bouillonkulturen über Nacht; 12 mM für SchwarmmedienBereiten Sie eine sterilisierte Stammlösung mit 1,2 M Filter in nanoreinem H2O vor. Nach dem Autoklavieren dem Medium zugeben.
Casaminosäuren (CAA)AmrescoNr. J8510,10 % (Gew./Vol.)Empfohlen für Studien zur Rankenbildung von P. aeruginosa . Vor dem Autoklavieren zu Medien hinzufügen.
Agar, edelSigma-AldrichNr. A54310,45 % (Gew./Vol.)Bevorzugter Noble-Agar für Untersuchungen der Oberflächenmotilität von P. aeruginosa . Vor dem Autoklavieren zu Medien hinzufügen.
Agar, edelAffymetrix109071,50 % (Gew./Vol.)Wird in Studien zur Oberflächenmotilität von M. xanthus verwendet. Nicht empfohlen für Studien zur Motilität von P. aeruginosa . Vor dem Autoklavieren zu Medien hinzufügen.
Agar, granuliertFisher ScientificNr. BP14230,60 % (Gew./Vol.) 
Higgins wasserfeste schwarze TuscheHigginsHIG442010,50 % (vol/vol)Mischen Sie die Tinte mit dem Inokulum, um die Oberflächenfeuchtigkeit des Schwarmmediums zu testen.
SYTO® 64 rot fluoreszierender Nukleinsäure-FarbstoffInvitrogenNr. S-11346 Verwenden Sie 4 μl (für P. aeruginosa) oder 8 μl (für M. xanthus) SYTO® 64 pro 100 ml geschmolzenen Agar (nach dem Autoklavieren zugegeben).
     
Relevante Materialien und Ausrüstungen:    
Petrischale, steril, 150 mm x 15 mm (Ø x H)VWR25384-326  
Petrischale, steril, 100 mm x 15 mm (Ø x H)VWR25384-342  
Petrischale, steril, 60 mm x 15 mm (Ø x H)VWR25384-092  
In-Vivo XtreamBruker  Verwendung für die makroskopische Bildgebung von Untersuchungen der Oberflächenmotilität. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html

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Schlagwörter

Swarming AssayBacterial MotilitySoft AgarTime lapse ImagingGreen Fluorescent ProteinTendril FormationImage AnalysisInoculation TechniqueHumidity ControlImaging System

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