Phasenkontrastmikroskopie zur Bewertung von Entwicklungsmutanten in Streptomyces

Abstract

Quelle: Bennett, J. A. et al. Visuelle und mikroskopische Bewertung von Streptomyces-Entwicklungsmutanten . J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt den Einsatz von Phasenkontrastmikroskopie zur Untersuchung phänotypischer Unterschiede zwischen Wildtyp- und mutiertem Streptomyces coelicolor. Es beschreibt die Schritte bei der Aufbereitung und Abbildung von Luftfilamenten, um Entwicklungsdefekte bei der Sporenbildung zu erkennen.

Protocol

1. Führen Sie eine Phasenkontrastmikroskopie durch

1. Sterilisieren Sie die Pinzette, indem Sie 70 % Ethanol einwaschen und dann durch eine Bunsenbrennerflamme laufen, um das Ethanol zu verdampfen. Abkühlen lassen.
2. Sterilisieren Sie Deckgläser, indem Sie sie in 70%igem Ethanol waschen und dann in einer sterilen Petrischale trocknen lassen.
3. Bereiten Sie ein Deckglaslifting des zu untersuchenden Bakterienwachstums vor.
   1. Nehmen Sie mit einer sterilen Pinzette ein steriles Deckglas und legen Sie das Deckglas auf eine Agarplatte aus Mannitol-Sojamehl (MS), auf der das Bakterienwachstum von Streptomyces coelicolor dicht ist. Drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette auf die Rückseite des Deckglases, um eine ausreichende Übertragung von Bakteriensporen und oberirdischem Myzel zu gewährleisten.
4. Nehmen Sie das Deckglas von der Platte und platzieren Sie es so, dass die Seite mit dem Zellmaterial zur Oberfläche eines Objektträgers zeigt, mit einem 15-μl-Tropfen 50 % Glycerin, der in Wasser für die Montage vorbereitet wurde. Reduzieren Sie Luftblasen, indem Sie das Deckglas in einem 45°-Winkel zum Objektträger platzieren und auf das 50%ige Glycerin fallen lassen.
5. (Fakultativ) Mit klarem Nagellack versiegeln, um die Folie zu erhalten.
6. Führen Sie Phasenkontrastmikroskopie in verschiedenen Zeitintervallen während der Lebenszyklen durch.
   ANMERKUNG: Die wiederholte Bildgebung ermöglicht eine vollständigere Analyse und die Fähigkeit, Verzögerungen in der Entwicklung zu erkennen. Wiederholen Sie die Beobachtungen unabhängig voneinander, um Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
   1. Legen Sie den vorbereiteten Objektträger auf den Mikroskoptisch und geben Sie einen Tropfen Immersionsöl in die Mitte des Deckglases. Drehen Sie das 100-fache Phasenobjektiv an Ort und Stelle und stellen Sie den Kondensatorrevolver auf die richtige "passende" Phaseneinstellung ein. Fokussieren Sie das Bild nur mit dem Feineinstellknopf, sobald die Objektivlinse mit dem Öl in Kontakt kommt.
   2. Untersuchen Sie mehrere Sichtfelder, um auffällige und konsistente Unterschiede zwischen mutierten Stämmen und dem Wildtyp zu erkennen, wie z. B. die Fähigkeit, Sporen zu bilden, die Sporengröße und -form sowie die Gesamtanzahl der Sporen (siehe Abbildung 1).
      ANMERKUNG: Alternativen zur Phasenkontrastmikroskopie sind die Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (DIC) und einfache Färbetechniken für den Einsatz mit Hellfeldmikroskopen, wie z. B. die Kristallviolett-Färbung.

Results

Abbildung 1: Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen, die ein repräsentatives oberirdisches Filament für weiße Streptomyces coelicolor-Mutantenstämme mit zufälligen Transposon-Insertionsmutationen zeigen....

Materials