Etablierung einer binären Kultur von Saccharibakterien mit Wirtsbakterien

Zusammenfassung

Quelle: Collins, A. J., et al., Etablierung stabiler binärer Kulturen von symbiotischen Saccharibakterien aus der Mundhöhle. J. Vis. exp. (2021)

Dieses Video zeigt die Etablierung und Aufrechterhaltung einer binären Kultur von Saccharibakterien und ihrem Wirtsbakterium durch sequentielle Co-Inkubation in wirtsspezifischem Wachstumsmedium.

Protokoll

1. Konzentrat von Saccharibakterienzellen durch Zentrifugation
   1. Machen Sie eine Orientierungsmarkierung auf dem Röhrchen und der Kappe und legen Sie das Röhrchen mit der Markierung auf der Oberseite in eine Hochgeschwindigkeitszentrifuge. Das durch Zentrifugation gebildete Pellet ist in der Regel unsichtbar. Die Markierung hilft bei der Bestimmung, wo sich das Pellet der Saccharibakterienzellen befindet, wenn die Zentrifugation durchgeführt und das Röhrchen aus der Zentrifuge genommen wird.
   2. Zentrifugieren Sie die Proben bei 60.000 x g für 1 h bei 4 °C.
      ANMERKUNG: Diese Kraft und Zeit reichen aus, um alle Saccharibakterienzellen zu pelletieren. Saccharibakterienzellen können jedoch zumindest teilweise pelletiert werden, indem sie nur 20 Minuten lang bei 20.000 x g zentrifugiert werden.
   3. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge. Gießen Sie die Flüssigkeit aus dem Rohr aus und halten Sie das Pellet auf der Oberseite des Rohrs.
   4. Resuspendieren Sie das normalerweise unsichtbare Pellet in 1-2 mL MRD-Puffer (Maximal Recovery Diluent) durch kräftiges Vortexen.

2. Infizieren Sie Wirtskulturen mit Saccharibakterien-angereichertem Filtrat

1. Bereiten Sie Kulturröhrchen vor, indem Sie 2 ml geeigneter Wachstumsmedien (z. B. TSBY (Tryptische Sojabrühe mit 0,1 % Hefeextrakt), BHI (Brain Heart Infusion) usw.) in Röhrchen aliquotieren.
2. 200 μl der Übernachtkultur der Wirtsorganismen werden in jedes Röhrchen gegeben. Geben Sie 100-200 μl resuspendierte, gefilterte Probe in jedes Röhrchen.
3. Kombinierte Proben werden entsprechend dem Wirtsorganismus inkubiert (z. B. 37 °C, in aerober Atmosphäre für Arachnia propionica).
4. Passieren Sie die Zellen alle zwei bis drei Tage, indem Sie 200 μl Binärkultur in ein neues Röhrchen auf 2 ml frisches Wachstumsmedium übertragen. Wenn es den Anschein hat, dass die passageierten Kulturen kein Wachstum zeigen (d.h. die Trübung/optische Dichte der Kultur nimmt nach der Passage in frische Medien nicht zu), könnten die Saccharibakterien alle Wirtsorganismen überwältigen oder töten. Um dies zu beheben, fügen Sie 200 μl nicht infizierte Wirtskultur hinzu, wenn Sie die Zellen passieren. Wiederholen Sie den Vorgang für mindestens 5 Passagen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Brain Heart Infusion Bouillon (dehydriertes Pulver)	Becton-Dickinson	211059	Oder andere für Zielorganismen geeignete Wachstumsmedien
Zentrifugen-Rotor 70-Ti	Beckman Coulter	337922
2 InVitro Handschuhfach steuern	Schüchterne Laoratorien	31615	Bei Bedarf für mikroaerobe Organismen
Optima L-100 XP Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1124
P-1000 Mikro-Pipette	Gilson	F123601G
P-200 Mikro-Pipette	Gilson	F123602G
PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung)	Fisher Scientific	BP399500
Pepton	Fisher Scientific	Artikel-Nr.: BP1420-500
Pipettenspitzen - 1000 μL	Fisher Scientific	02-717-166
Pipettenspitzen - 200 μL	Fisher Scientific	02-717-165
Konische Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss 15 mL	Falke	352096	Oder ein anderes Röhrchen, das für die Bakterienkultur geeignet ist
Zentrifugenröhrchen aus dickwandigem Polycarbonat 25 x 89 mm (26,3 ml Fassungsvermögen) mit Verschlüssen	Beckman Coulter	355618
Tryptische Sojablut-Agar-Platten	Labordienstleistungen im Nordosten	Nr. P1100	Oder eine andere Agarplatte, die für das Wachstum von Wirtsorganismen ausreicht
Tryptische Sojabrühe (dehydriertes Pulver)	Becton-Dickinson	211825	Oder andere für Zielorganismen geeignete Wachstumsmedien
Hefeextrakt	Fisher Scientific	Nr. BP1422-500