Subkultivierung von sulfitreduzierenden anaeroben Bakterien aus einer Agarkultur

Zusammenfassung

Quelle: Anwar, Z., et al. Anreicherung und Nachweis von Clostridium perfringens-Toxinotypen in Lebensmitteleinzelhandelsproben. J. Vis. Exp. (2019).

In diesem Video werden sulfitreduzierende Bakterien in einem sulfithaltigen Agarmedium kultiviert, wo sie anaerob wachsen und Sulfit zu Schwefelwasserstoff reduzieren, wobei sie mit Eisenionen schwarze Ausfällungen bilden. Schwarze Kolonien werden mit aseptischen Techniken aus der Agartiefe isoliert und zur fortgesetzten anaeroben Inkubation in frisches Medium überführt.

Protokoll

HINWEIS: Clostridium perfringens gilt als Organismus der Biosicherheitsgefährdung Stufe 2 (BSL2). Obwohl nicht alle Lebensmittelproben C. perfringens enthalten, sollten alle kultivierten Proben als solche behandelt werden. Alle angemessenen Vorsichtsmaßnahmen und persönliche Schutzausrüstung (PSA) sollten jederzeit getragen werden. Dekontaminieren Sie das gesamte Material vor der Entsorgung.

1. Bereiten Sie modifizierte RPM (Rapid Perfringens Medium) vor

1. Kombinieren Sie 30 g/l flüssiges Thioglycolatmedium, 60 g/l Gelatine, 5 g/l Pepton, 5 g/l Glukose, 5 g/l Kaliumphosphat zweibasisch, 3 g/l Hefeextrakt, 1,5 g/l Natriumchlorid, 0,5 g/l Eisensulfat in deionisiertem Wasser, bis es gleichmäßig verteilt ist. Wir stellen in der Regel 1-Liter-Chargen her.
2. Autoklav bei 121 °C für 15 min.
3. Auf ca. 40 °C abkühlen lassen.
4. Sobald die Drehzahl abgekühlt ist, fügen Sie D-Cycloserin bis zu einer Endkonzentration von 440 mg/l hinzu.
   ANMERKUNG: Stammkonzentrationen von D-Cycloserin, gelöst in sterilem Wasser bei 50 mg/ml, können für die zukünftige Verwendung bei -20 °C gelagert werden.
5. Aseptischer Transfer von 10 mL RPM auf konische 15 mL Röhrchen. RPM kann chargenweise hergestellt und bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.
6. Vor dem Gebrauch die Drehzahl auf 37 °C erwärmen.

2. Probenentnahme und RPM-Inkubation

1. Transportieren Sie Lebensmittel innerhalb von 1 h unter Umgebungstemperatur ins Labor. Lebensmittel können in Originalverpackungen oder sterilen Behältern transportiert werden. Wenn sie nicht sofort getestet werden, können Lebensmittel bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert werden. Falls vorhanden, notieren Sie die Art des Lebensmittels und das Herkunftsland gemäß dem Verpackungsetikett sowie alle anderen relevanten Informationen.
2. Entfernen Sie ca. 1,0–2,0 g Lebensmittel und geben Sie sie in eine sterile Petrischale oder ein gleichwertiges Material. Mit einer sterilen Rasierklinge oder einem Skalpell fein hacken.
3. In 10 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einem konischen 15-ml-Röhrchen impfen. Gut mischen.
   1. Zur Selektion für vegetative Zellen geben Sie 5 mL der PBS-Lebensmittelmischung in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 mL RPM. Den Deckel fest verschließen.
   2. Um nach Sporen zu selektieren, erhitzen Sie die restlichen 5 mL der PBS-Lebensmittelmischung 15 Minuten lang bei 85 °C und geben Sie sie dann in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit 10 mL RPM. Den Deckel fest verschließen.
4. Die Lebensmittel-RPM-Kulturen vortexen und invertieren, um eine vollständige Durchmischung zu gewährleisten.
5. Verschließen Sie die konischen Röhrchen fest und wickeln Sie die Deckel mit Paraffinfolie oder Plastikfolie ein, um eine anaerobe Umgebung zu gewährleisten.
6. Über Nacht (ON) bei 37 °C inkubieren.
7. Achten Sie am nächsten Morgen auf Trübungen oder Gärungen in den RPM-Röhrchen.

3. TSC (Tryptosesulfitcycloserin) "Sandwich"-Beschichtung

1. Injizieren Sie ON RPM-Kulturen in TSC-Agar unter Verwendung einer unten beschriebenen "Sandwich"-Technik (Abbildung 1).
2. Bereiten Sie TSC-Agar gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
   1. Bereiten Sie die Basisschicht der TSC-Platten vor, indem Sie 10 mL geschmolzenen TSC-Agar in sterile Petrischalen geben und verfestigen lassen. Diese können im Voraus zubereitet und bei 4 °C gelagert werden. Stellen Sie sicher, dass die Platten vor der Verwendung auf Raumtemperatur erwärmt werden.
   2. Halten Sie für die oberste Schicht der TSC-Platte den restlichen geschmolzenen TSC-Agar bei 40 °C.
      ANMERKUNG: Obwohl der Schmelzpunkt von Agar über 85 °C liegt, verfestigt sich geschmolzener Agar bei etwa 32–45 °C.
3. Entnehmen Sie vorsichtig die ON RPM-Kulturen und übertragen Sie 100 μl auf die TSC-Agarbasis. Aufgrund der Fermentation können einige Kulturen unter Druck geraten. Achten Sie darauf, die entsprechende PSA zu tragen.
4. Verteilen Sie das RPM-Inokulum mit sterilisierten Glasperlen oder einem Zellspreizer.
5. Lassen Sie RPM 5–10 Minuten lang bei Raumtemperatur in den TSC-Agar "absorbieren".
6. Übertragen Sie vorsichtig 20 ml geschmolzenen TSC-Agar mit einer serologischen Pipette auf die Platte.
7. Setze den Deckel der Petrischale wieder auf und lasse den TSC-Agar bei Raumtemperatur vollständig erstarren.
8. Die Petrischale umdrehen und bei 37 °C inkubieren.
9. Wenn serielle Verdünnungen gewünscht werden, führen Sie vor der Inokulation in TSC-Agar Verdünnungen der ON RPM-Kulturen in frische, vorgewärmte RPM durch.

4. Subkulturierung von sulfitreduzierenden Völkern

1. Nehmen Sie am nächsten Morgen die Platten aus dem Inkubator und untersuchen Sie sie auf Bakterienwachstum. Auf der Oberfläche des Agars können aerobe Bakterien vorhanden sein. Anaerobe Bakterien wachsen eingebettet in den Agar. Sulfit-reduzierende Bakterien färben den umgebenden Agar schwarz. Mögliche Kolonien von C. perfringens sind schwarz und in den Agar eingebettet.
2. C. perfringens vermutete Kolonien sind positiv für die Sulfitreduktion und erscheinen schwarz, eingebettet in den Agar. Mit einer sterilen Einwegpipette die schwarzen Kolonien aus dem Agar "zupfen" und in einem konischen 15-ml-Röhrchen auf 10 ml frische RPM überführen. Es ist wichtig, dass die Luft aus der Pipette vor dem Durchstechen des Agars ausgestoßen wird.
3. Wenn sich auf der Oberfläche der Platte eine große Menge an aerobem Bakterienwachstum befindet, verwenden Sie einen sterilen Zellschaber, um Kolonien aus ausgewählten Bereichen zu entfernen. Mehrere Kolonien, bei denen der Verdacht auf C. perfringens besteht, können von derselben TSC-Platte in separate RPM-Kulturen entnommen werden.
4. Verschließen Sie die konischen Röhrchendeckel fest und wickeln Sie sie in Paraffinfolie oder Plastikfolie ein. Inkubieren Sie ON bei 37 °C.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der TSC-Agar-Sandwich-Technik.

RPM-Medien, die die C . perfringens-Bakterien enthalten, werden zwischen zwei Schichten TSC-Agar plattiert, um ein anaerobes Milieu zu fördern.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
D-Cycloserin	Sigma-Aldrich	Nr. C6880
Dextrose	Sigma Lebenswissenschaften	D9434-250G
Einweg-Transferpipetten	Jede Marke		Wählen Sie eine mit schlanker Spitze wie Thermo Scientific Einweg-Transferpipetten 137116M/EMD
DNeasy Blut- und Gewebe-Kits	Qiagen	69504	Hinweis: Es wurden zahlreiche DNA- und Plasmid-Extraktionskits evaluiert, wobei dieses Kit die wünschenswertesten Ergebnisse lieferte.
Trocken-Inkubator	Jede Marke
Flüssiges Thioglycolat-Medium	Remel	R453452
Gelatine aus Schweinehaut	Sigma Lebenswissenschaften	G1890-500G
Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat	Sigma Lebenswissenschaften	F8633-250 G
Lysozym aus Hühnereiweiß	Sigma-Aldrich	Nr. L6876	Wird für die DNA-Extraktion benötigt, nicht im Kit enthalten
Parafilm oder Plastikfolie	Jede Marke
Pepton aus Kasein und anderen tierischen Proteinen	Sigma-Aldrich	70173-100G
Perfringens-Agar-Basis (TSC + SFP)	Oxoid	Nr. CM0587	TSC-Agar nach Anleitung herstellen
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	Nr. P2222-100G
Natriumchlorid	Sigma-Aldrich	Nr. S-7653
Steriler Zellschaber	Jede Marke
Steriler Zell-Spreader	Jede Marke
Sterile Petrischalen	Jede Marke
Hefeextrakt	Sigma-Aldrich	70161-100G