Dünnschichtchromatographie-basierte Trennung von (p)ppGpp-Nukleotiden, die aus stressinduzierten Bakterien isoliert wurden

1. Dünnschicht-Chromatographie
   1. Markieren Sie mit einem weichen Bleistift eine Ursprungslinie 1 cm vom Rand der 20 cm x 20 cm großen Polyethylenimin-Zellulose-Dünnschichtchromatographie (DC)-Platte, die mit einer Schere 5 cm von der Oberseite entfernt wurde. Tragen Sie für jede Probe 5 μl als Tröpfchen auf die PEI-Oberfläche auf. Beginnen Sie mit der aufsteigenden Entwicklung, ohne diesen Fleck trocknen zu lassen, was die Auflösung verbessert, indem die Streifenbildung minimiert wird.
   2. Führen Sie die aufsteigende Entwicklung in einem Tank mit einer Schicht aus 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,4) Lösung durch, die flach genug ist, damit die Flüssigkeit den Ursprungsprobenfleck nicht berührt. Decken Sie den Tank mit einem luftdichten Verschluss ab und lassen Sie die Flüssigkeit bis zur Oberseite des beschnittenen Blechs aufsteigen, 15 cm. Um einen pH-Wert von 3,4 für eine 1,5 M KH₂PO₄ Lösung zu erreichen, ist es notwendig, den pH-Wert durch Zugabe von H₃PO₄ einzustellen.
   3. Entfernen Sie das voll entwickelte Chromatogramm und trocknen Sie es an der Luft bei Raumtemperatur.
   4. Der obere Teil (pH-Front) des Chromatogramms, der das freie ³²P enthält, wird abgeschnitten und in den radioaktiven Abfall gegeben. Dieser Teil ist in Abbildung 1 in gelber Farbe dargestellt und unter UV-Licht leicht zu visualisieren. Wenn nur (p)ppGpp-Nukleotide gemessen werden, die langsamer als Guanosintriphosphat (GTP) wandern, wird empfohlen, einen UV-sichtbaren GTP-Standard zu verwenden und dann einen größeren oberen Teil zu schneiden und zu verwerfen (alles über GTP, wie in Abbildung 1 gezeigt).
   5. Belichten Sie autoradiografische Filme über Nacht mit einem Phosphorschirm.
   6. Entwickeln Sie den Film. Erfassen und quantifizieren Sie das Phosphor-Screen-Signal mit einem Phosphoimager.
       
2. Quantifizierung von (p)ppGpp
   1. Quantifizieren Sie radioaktive Flecken mit Bild J.
      ANMERKUNG: Die Menge an (p)ppGpp kann auf die Gesamtmenge an G-Nukleotiden normalisiert werden, die in jeder Probe beobachtet wurde (Abbildung 1). Wenn die Menge des Hintergrunds homogen ist, kann eine einzelne Lücke (Kasten 4 aus Abbildung 1) subtrahiert werden, um den Hintergrund zu korrigieren. Gesamt-G ist die Summe aus nachgewiesenem GTP + ppGpp + pppGpp. Diese Normalisierung geht davon aus, dass die Konzentrationen von Guanosinmonophosphat (GMP) und Guanosindiphosphat (GDP) vernachlässigbar sind, was für Escherichia coli gilt. Das Verhältnis eines gegebenen Nukleotids zu Gesamt-G bietet eine wichtige Methode zur Korrektur von Schwankungen im applizierten Probenvolumen.

Abbildung 1: Repräsentative TLC-Analyse. Schematische Darstellung der Ergebnisse, die nach der Autoradiographie und dem Phosphor-Screening über Nacht mit dem TLC erzielt wurden. Die zu messenden Spots sind rot dargestellt. Die Formel zur Berechnung des Bruchteils von ppGpp ist ebenfalls dargestellt. Gesamt-G bezieht sich auf die Gesamtmenge an GTP + ppGpp + ppppGpp, die in der Probe nachgewiesen wurde. Das gelbe Band stellt die pH-Front dar, die unter UV-Licht sichtbar ist. Die Schere zeigt an, wo wir empfehlen, das Chromatogramm zu schneiden, um den größten Teil der Radioaktivität zu verwerfen. Der Pfeil zeigt die Richtung der Strömung während der aufsteigenden Entwicklung mit 1,5 M Phosphatpuffer