Einzelzellkultur von Bakterien in riesigen Vesikeln

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Morita, M., et al. Bakterielle Zellkultur auf Einzelzellebene in riesigen Vesikel. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt eine Methode zur Kultivierung und Beobachtung einzelner Bakterienzellen, die in riesigen Vesikeln eingekapselt sind, die an einer gestützten Lipiddoppelschicht verankert sind. Das System ermöglicht eine stabile, langfristige Abbildung der Wachstumsdynamik einzelner Zellen in einer begrenzten, physiologisch relevanten Mikroumgebung.

Protokoll

1. Vorbereitung eines Riesenvesikels (GV) Beobachtungssystem (Bacterial Cell Culture System)

Präparation von kleinen Vesikeln (SVs) für den Aufbau einer gestützten Doppelschichtmembran
1. Gießen Sie 20 μl der POPC-Lösung (1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin) und 4 μl der Biotin-PEG-DSPE (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[biotinyl(polyethylenglykol)-2000)-Lösung in ein Glasröhrchen.
2. Verdampfen Sie das organische Lösungsmittel durch Luftstrom, um einen Lipidfilm zu bilden, und legen Sie diese Probe für 1 h in einen Exsikkator, um das organische Lösungsmittel vollständig zu verdampfen.
3. Geben Sie 200 μl 200 mM Glukose in 1x LB (Luria-Bertani-Brühe) Medium (die äußere wässrige Lösung von GVs) in das Glasfläschchen.
4. Wickeln Sie den Öffnungsteil des Glasfläschchens mit Folie ein und beschallen Sie es mindestens 1 h lang in einem Ultraschallbad (120 W).
5. Bereiten Sie SVs im Extrusionsverfahren mit einem Mini-Extruder und einer Polycarbonatmembran mit einer Porengröße von 100 nm vor.
Vorbereitung einer handgefertigten Kammer
1. Bohren Sie mit einem Hohlstempel ein 7 mm breites Loch auf eine doppelseitige Dichtung (10 mm x 10 mm x 1 mm).
2. Kleben Sie die doppelseitige Dichtung mit dem Loch auf ein Deckglas (30 mm x 40 mm, Dicke 0,25–0,35 mm).
Vorbereitung einer gestützten Doppelschichtmembran auf dem Deckglas im Loch der Kammer
1. 30 μl der SV-Lösung werden in das Loch der Kammer (vorbereitet in Abschnitt 2.2) gegeben und 30 Minuten lang bei RT inkubiert.
2. Waschen Sie das Loch zweimal vorsichtig mit 20 μl 1x LB Medium, das 200 mM Glukose (die äußere wässrige Lösung von GVs) enthält, indem Sie es pipettieren.
Immobilisierung von GVs auf der gelagerten Doppelschichtmembran auf dem Deckglas im Loch der Kammer
1. 10 μl Neutravidin mit der äußeren wässrigen Lösung von GVs (1 mg/ml) in das Loch einführen und 15 Minuten lang bei RT inkubieren.
2. Waschen Sie das Loch zweimal vorsichtig mit 20 μl 1x LB Medium, das 200 mM Glukose (die äußere wässrige Lösung von GVs) enthält, indem Sie es pipettieren.
3. Geben Sie die gesamte GVs enthaltende Lösung in das Loch der Kammer und verschließen Sie sie mit einem Deckglas (18 mm x 18 mm, Dicke 0,13–0,17 mm) (Abbildung 1b).
Mikroskopische Beobachtung des bakteriellen Zellwachstums in GVs
1. Stellen Sie ein mikroskopisches Heiztischsystem mit einem inversen Mikroskop ein, das mit einem Objektiv mit 40x/0,6 numerischer Apertur (NA) und einem großen Arbeitsabstand ausgestattet ist (Abbildung 1b).
2. Stellen Sie die Kammer auf das mikroskopische Heiztischsystem (Abbildung 1b). Die GVs, die Bakterienzellen enthalten, werden in der Kammer unter statischen Bedingungen 6 h bei 37 °C inkubiert.
3. Erfassen und zeichnen Sie alle 30 Minuten Mikroskopbilder des bakteriellen Zellwachstums in GVs auf, indem Sie eine wissenschaftliche sCMOS-Kamera (Complementary Metal Oxide Semiconductor) verwenden.

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Ergebnisse

Abbildung 1: Das Beobachtungssystem von bakteriellen Zellkulturen in GVs. (a) GVs werden auf einer Trägermembran durch Biotin-Neutravidin-Bindung auf dem Deckglas immobilisiert. GVs werden durch ein Heizsystem inkubiert. (