Untersuchung der bakteriellen Reaktion auf Ethylen mit einer Ethylen-freisetzenden Verbindung

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Augimeri, R. V. et. al., Verwendung der Ethylen-freisetzenden Verbindung 2-Chlorethylphosphonsäure als Werkzeug zur Untersuchung der Ethylenreaktion in Bakterien. J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Wirkung von Ethylen, das von 2-Chlorethylphosphonsäure (CEPA) erzeugt wird, auf das Bakterienwachstum und die Zelluloseproduktion. Ethylen aktiviert Signalwege, die die Zellulosesynthese stimulieren, was zu einer verstärkten Pellikelbildung führt. Diese Ergebnisse unterstreichen die bakterielle Reaktion auf Ethylen.

Protokoll

Pellicle-Assays
1. Züchtung und Quantifizierung von Komagataeibacter xylinus-Starterkulturen in dreifacher Ausfertigung:
  1. In dreifacher Ausfertigung wird eine einzelne Kolonie von Komagataeibacter xylinus in 5 ml Schramm und Hestrin (SH) -Medium (pH 5) geimpft, das mit 0,2 % (v/v) filtersterilisierter Cellulase ergänzt wird. Die Kulturen werden bei 30 °C unter Rühren bei 150 U/min inkubiert, bis eine optische Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) von 0,3 bis 0,4 erreicht ist (ca. 72 Stunden).
  2. Ernte der Starterkulturen durch Zentrifugation (2.000 x g; 4 °C; 10 min). Waschen Sie die Zellen zweimal mit 5 ml steriler Kochsalzlösung und resuspendieren Sie das Zellpellet. Halten Sie die Zellen auf Eis.
  3. Quantifizieren Sie Zellen mit einer Petroff-Hausser-Zählkammer.
2. Bereiten Sie Master-Mixe vor, um 24-Well-Platten zu impfen:
  1. Ergänzen Sie 60 ml SH-Medium (pH 7) mit 120 μl der 5-, 50- und 500 mM-2-Chlorethylphosphonsäure (CEPA)-Bestände, um CEPA-Endkonzentrationen von 0,01, 0,1 bzw. 1,0 mM zu erhalten. Ergänzen Sie weitere 60 ml SH-Medium (pH 7) mit 120 μl des Lösungsmittels, das zum Auflösen von CEPA verwendet wird. Vortex zum Mischen.
  2. Jeweils 60 ml CEPA-haltiges Medium werden in vier 14-ml-Aliquote aufgeteilt. Drei der 14-ml-Aliquoten werden mit biologischen Replikaten der Starterkultur in einer Konzentration von 10⁵ Zellen/ml beimpft. Bewahren Sie die Röhrchen mit den Zellen auf Eis auf, um die Zelluloseproduktion zu verhindern.
    ANMERKUNG: Die restlichen 14 ml Aliquot werden für sterile Kontrollwells verwendet.
3. 24-Well-Platten impfen:
  1. Testen Sie jede Behandlung in einer eigenen Platte mit drei Reihen biologischer Replikate und einer Reihe steriler Kontrollen (Abbildung 1).
  2. Geben Sie mit dem 14-ml-Mastermix 2 ml in jede der sechs Vertiefungen einer sterilen 24-Well-Platte. Vollständig für die drei biologischen Replikate und die sterile Kontrolle (Abbildung 1). Wiederholen Sie dies für jede Behandlung.
  3. Platten mit Paraffinfolie verschließen und 7 Tage bei 30 °C statisch inkubieren.
  4. Ernte und Messung des Trockengewichts der Pellicle (Zelluloseausbeute) (Abbildung 1):
    1. Übertragen Sie die Pellikel einzeln in die Vertiefungen einer 6-Well-Platte. Um die Zellen zu lysieren, behandeln Sie die Pellikel 20 Minuten lang mit 12 ml 0,1 N Natriumhydroxid (NaOH) bei 80 °C.
    2. Entfernen Sie das NaOH und neutralisieren Sie die Pellikel, indem Sie es 24 Stunden lang mit ultrareinem Wasser unter Rühren waschen. Wechseln Sie das Wasser alle 6 Stunden.
      ANMERKUNG: Die Pellikel sollten nach Abschluss des Waschschritts weiß sein.
    3. Legen Sie die Pellikelgewichte auf Silikonmatten und trocknen Sie sie 48 Stunden lang bei 50 °C bei gleichbleibendem Gewicht. Sobald sie getrocknet sind, nehmen Sie sie von den Matten und messen Sie ihr Gewicht auf einer Analysewaage, um die Ausbeute an bakterieller Zellulose zu bestimmen.

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Ergebnisse

Abbildung 1: Flussdiagramm, das das Protokoll für den Pellikel-Assay und die Analyse veranschaulicht. CEPA-supplementiertes pH 7 SH-Medium (60 ml) wird für drei separate biologische Replikatinokulationen und eine sterile Kontrolle (je 14 ml) aliquotiert. Diese Kulturen we...