Isolierung gramnegativer Bakterien mit genomischen Transposon-Insertionen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Kazi, M. I., et. al., Generierung von Transposon-Insertionsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Hochdurchsatz-Sequenzierung. J. Vis. exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Selektion, Quantifizierung und Konservierung von Gram-negativen Empfängerbakterien, die Transposon-Insertionen auf der Grundlage von Kanamycin-Resistenz tragen.

Protokoll

Generierung der endgültigen bakteriellen Mutantenbibliothek

Tauen Sie ein Aliquot der gefrorenen Paarung auf Eis auf.
Plattenpaarung auf 150 mm Luria-Bertani (LB) Agarplatten, ergänzt mit Kanamycin, basierend auf koloniebildenden Einheiten (KBE), berechnet in Schritt 3.1. Passen Sie das Volumen mit LB an, um vor dem Plattieren 13.333 Kolonien pro 150 μl zu erhalten.
ANMERKUNG: Die KBE-Zahl wurde hier auf etwa 10⁵ KBE/ml bestimmt, so dass das Paarungsvolumen angepasst wurde, um 13.333 Kolonien pro Platte zu erhalten. Dies würde eine optimale Anzahl von Kolonien auf 30 Platten für eine hochauflösende Mutantenbibliothek liefern, ohne die Platten zu überfüllen.
Verwenden Sie sterile Glasperlen, um 150 μl der Verdünnung pro Platte auf 30 x 150 mm Luria-Bertani-Agar-Platten zu verteilen, die mit Kanamycin ergänzt werden, um 400.000 Kolonien zu erhalten (Abbildung 1C).
ANMERKUNG: Sterile Stäbchen oder jede Art von sterilem Spreizwerkzeug (z. B. Glasperlen) können verwendet werden, um die Bakterien auf Platten zu verteilen.
Entsorgen Sie das gebrauchte Rohr mit überschüssigem Gegenstück.
ANMERKUNG: Gefrier-/Auftauzyklen erhöhen den Selektionsdruck auf die Bakterienkultur, was die Tn-seq-Experimentergebnisse verzerren kann. Verwenden Sie jedes Mal ein frisches Aliquot.
Die Platten bei 37 °C 14 h inkubieren.
ANMERKUNG: Die Inkubationszeit ist optimiert, um ein Überwuchern (Berühren der Kolonien) zu verhindern. Es wird empfohlen, das Wachstum durch Verkürzung der Inkubationszeit zu minimieren.

Schätzung der Bibliotheksdichte und des Poolings für die Speicherung

Zählen Sie die KBEs auf jeder Platte, um die Gesamtzahl der Mutanten in der Transposonbibliothek zu schätzen. Zählen Sie 20 % von mindestens 3 Platten, um die Schätzung der Koloniezahl für die gesamte Plattengruppe zu bestimmen (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass die Völker keine andere Kolonie berühren.
Nachdem Sie den geschätzten Koloniertrag berechnet haben, geben Sie 3-5 ml LB (oder mehr, falls erforderlich) auf jede Platte und kratzen Sie die Bakterien mit einem sterilen Schaberwerkzeug ab. ANMERKUNG: Sterile Impfösen wurden verwendet, um die Platten effizient zu kratzen.
Sammeln Sie bakterielle Suspensionen von allen Platten in konische 50-ml-Röhrchen (Abbildung 1D). Dazu sind mehrere konische 50-ml-Röhrchen erforderlich, mindestens 3.
Pelletgepoolte Bakteriensuspension durch Zentrifugation bei 5.000 x g für 7 min.
Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 5 mL LB, ergänzt mit 30 % Glycerin.
1 mL der Transposonbibliothek in Kryoröhrchen aliquotieren und bei -80 °C lagern.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Aufbaus der Transposon-Mutantenbibliothek. (A) Bakterielle Konjugation. Der "Donor"-Stamm, der die Transpositionsmaschinerie kodiert, wurde mit dem "Empfänger"-Stamm gemischt. Das Gemisch wurde auf Luri...