Isolierung gramnegativer Bakterien mit genomischen Transposon-Insertionen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle: Kazi, M. I., et. al., Generierung von Transposon-Insertionsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Hochdurchsatz-Sequenzierung. J. Vis. exp. (2020)

Dieses Video zeigt die Selektion, Quantifizierung und Konservierung von Gram-negativen Empfängerbakterien, die Transposon-Insertionen auf der Grundlage von Kanamycin-Resistenz tragen.

Protokoll

Generierung der endgültigen bakteriellen Mutantenbibliothek

Tauen Sie ein Aliquot der gefrorenen Paarung auf Eis auf.
Plattenpaarung auf 150 mm Luria-Bertani (LB) Agarplatten, ergänzt mit Kanamycin, basierend auf koloniebildenden Einheiten (KBE), berechnet in Schritt 3.1. Passen Sie das Volumen mit LB an, um vor dem Plattieren 13.333 Kolonien pro 150 μl zu erhalten.
ANMERKUNG: Die KBE-Zahl wurde hier auf etwa 10⁵ KBE/ml bestimmt, so dass das Paarungsvolumen angepasst wurde, um 13.333 Kolonien pro Platte zu erhalten. Dies würde eine optimale Anzahl von Kolonien auf 30 Platten für eine hochauflösende Mutantenbibliothek lie....

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Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Aufbaus der Transposon-Mutantenbibliothek. (A) Bakterielle Konjugation. Der "Donor"-Stamm, der die Transpositionsmaschinerie kodiert, wurde mit dem "Empfänger"-Stamm gemischt. Das Gemisch wurde auf Luri.......