Kompetenzinduzierte DNA-Aufnahme in Staphylococcus aureus

Zusammenfassung

Quelle: Cafini, F., et.al. Methodik zur Untersuchung des horizontalen Gentransfers bei Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video zeigt die kompetenzinduzierte DNA-Aufnahme in Staphylococcus aureus durch natürliche Transformation. Ein Chloramphenicol-empfindlicher Stamm, der so entwickelt wurde, dass er konstitutiv einen Sigma-Faktor exprimiert, wird unter nährstofflimitierenden Bedingungen kultiviert, um die Kompetenz zu verbessern, und dann mit Spender-DNA inkubiert, die ein Resistenzgen trägt. Der erfolgreiche Gentransfer wird durch das selektive Wachstum von Chloramphenicol-resistenten Transformanten bestätigt.

Protokoll

1. Natürliche Verwandlung

ANMERKUNG: Als Empfänger wurde das N315-Derivat N2-2.1 verwendet. In diesem Stamm wurde der sigH-Locus dupliziert, um SigH konstitutiv zu exprimieren. Wenn der zu übertragende Resistenzmarker nicht Chloramphenicol ist, kann pRIT-sigH (Cm^R) zur Expression von SigH verwendet werden. Als Spender-DNA für die Transformation wird ein gereinigtes Plasmid oder ein ganzer DNA-Extrakt aus cfr erworbenem S. aureus COL-45 verwendet.

1. Aufbereitung der Spender-DNA
   1. COL-45 über Nacht unter Schütteln bei 37 °C in einem 300-ml-Kolben kultivieren, der 50 ml tryptische Sojabrühe (TSB) enthält, ergänzt mit 32 mg/l Chloramphenicol. Kultur von E. coli HST04 mit pHY300-Plasmid ^(TetR) zur Extraktion des Plasmids für das Kontrollexperiment.
      ANMERKUNG: HST04 (dam-/dcm-) fehlen die DNA-Methylase-Gene. Auch andere konventionelle Stämme mit DNA-Methylasen können zur Präparation des DNA-Donors verwendet werden, da der DNA-Methylierungszustand die Transformationseffizienz nicht beeinflusst. Alternativ kann auch pT181-Plasmid, das aus dem S. aureus COL-Stamm aufgereinigt wurde, als Positivkontrolle für den Transformationsassay verwendet werden.
   2. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation (8.000 x g für 10 min bei 4 °C).
   3. Extrahieren Sie die Plasmide mit einem Plasmid-DNA-Extraktionskit oder einer herkömmlichen DNA-Aufreinigungsmethode, um die gesamte DNA zu reinigen.
   4. Quantifizieren Sie die gereinigte DNA mit einem Spektrometer und halten Sie sie bis zur Verwendung bei 4 °C.
      ANMERKUNG: Verwenden Sie für den Transformationsassay ein frisches DNA-Präparat, das in der Regel weniger als eine Woche alt ist. Alte DNA-Präparate verringern die Effizienz der Transformation.
2. Transformations-Assay
   1. Die Empfängerzelle (N2-2.1) wird über Nacht in 5 ml TSB bei 37 °C unter Schütteln kultiviert.
   2. 0,5 ml der Übernachtkultur in ein 1,5-ml-Röhrchen überführen. Die Zellen durch Zentrifugation ausfällen (10.000 x g für 1 min bei 4 °C).
   3. Suspendieren Sie die Zellen mit 10 mL CS2-Medium in einem 50-ml-Röhrchen.
      ANMERKUNG: CS2-Medium ist ein vollständiges synthetisches Medium, das bei S. aureus Kompetenz für die natürliche Transformation induziert. Andere Standard-Labormedien wie TSB oder Hirn-Herz-Infusion (BHI) sind nicht für die Transformation geeignet.
   4. Züchten Sie die Bakterien bei 37 °C unter Schütteln (180 U/min) bis zur späten exponentiellen Phase (ca. 8 h).
   5. Ernte der Zellen durch Zentrifugation (5.000 x g für 5 min bei 4 °C).
   6. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml frischem CS2-Medium.
   7. 10 μg gereinigte Plasmid- oder Genom-DNA (Schritt 1.1.4) zur Zellsuspension geben. Bei 37 °C und 180 U/min 2,5 Std. schütteln.
      ANMERKUNG: Kürzere Inkubationszeiten mit DNA (<2,5 Stunden) führen zu niedrigeren Transformationsfrequenzen.
   8. Zellen durch Zentrifugation sammeln (5.000 x g für 5 min bei 4 °C).
   9. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 ml BHI-Medium. Mischen Sie die Zellsuspension mit 90 ml geschmolzenem BHI-Agar (55 °C) und 32 mg/l Chloramphenicol (oder 5 mg/l Tetracyclin im Kontrollexperiment). Gießen Sie die Mischung in die 90 mm Petrischale. Schnell abkühlen lassen und das Agar fest werden lassen.
   10. Inkubieren Sie die Platten 2 Tage lang bei 37 °C.
   11. Replizieren Sie die erzeugten Kolonien (Transformanten), indem Sie die Kolonien (mit Zahnstochern) auf neue BHI-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika übertragen, um ihre Resistenzeigenschaften zu bestätigen. Bestätigen Sie das erworbene Resistenzgen (cfr oder tetM) durch Kolonie-PCR.

Materialien