Ein flüssiger Multiwell-Assay für das Screening von C. elegans-Knockdowns

Zusammenfassung

Quelle: Anderson, Q. L. et al. Ein Pathosystem von C. elegans mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt auf Flüssigkeitsbasis. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt eine Hochdurchsatz-Screening-Methode mit Caenorhabditis elegans , um Gen-Knockdowns während Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Es beschreibt das Verfahren zur Aufbereitung von Knockdown-Würmern und deren Übertragung auf Testplatten, um die Auswirkungen der erregerinduzierten Wurmabtötung zu bewerten.

Protokoll

1. Anpassung für das Screening mehrerer Caenorhabditis elegans-Stämme oder -Knockdowns (Ribonukleinsäure-Interferenz (RNAi)-Screen-Setup)

Anmerkung: Dies ist ein RNAi-Screening, das für einen 24-Well-Plattenaufbau beschrieben wurde.

1. Fügen Sie 1 ml S Basal pro Vertiefung einer 24-Well-Platte hinzu, die Würmer enthält, die mit RNAi besiedelt wurden. Rühren Sie die Würmer vorsichtig auf, indem Sie die Platte schütteln, und geben Sie die Würmer dann auf eine leere, sterile 24-Deep-Well-Platte. Lassen Sie die Würmer sich durch die Schwerkraft ansiedeln (~5 Minuten).
2. Überstand aspirieren, wobei ca. 1 ml übrig bleibt. Geben Sie 7 ml S Basal in jede Vertiefung.
3. Wiederholen Sie die Schritte 1.1 - 1.2 mindestens noch 2 Mal. Nach der abschließenden Wäsche ist der Überstand zu aspirieren, so dass ca. 400 μl übrig bleiben.
4. Sortieren Sie mit der Resampler-Funktion des Wurmsortierers 22 Würmer aus der 24-Well-Platten-Wurmsuspension in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte (jede Vertiefung einer 24-Well-Platte ergibt 8 - 12 Vertiefungen einer 384-Well-Platte).
   1. Um Hunger zu vermeiden, pipettieren Sie Bakterien vor dem Sortieren in 384-Well-Platten (entweder einen Stamm, der ausschließlich als Lebensmittel dient, wie z. B. OP50, oder einen pathogenen Stamm).
5. Nachdem die Würmer in die 384-Well-Platte sortiert wurden, fügen Sie kleine Moleküle oder andere experimentspezifische Materialien hinzu.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		Durchflusszytometer / Wurmsortierer für große Objekte
24 Deep-Well-RB-Block	Thermo Fisher Scientific	CS15124
384-Well-Platte	Greiner Bio-One	Hersteller-Art.nr. 781091
Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)			Menge pro Liter: 18 Gramm Agar, 3 Gramm NaCl, 2,5 Gramm Pepton, 1 ml Calciumchlorid (1 M), 1 ml Magnesiumsulfat (1 M), 25 ml Phospatpuffer und 973 ml Milli-Q Wasser
S Basal			Menge pro Liter: 5,85 Gramm NaCl, 6 Gramm monobasisches Kaliumphosphat, 1 Gramm zweibasisches Kaliumphosphat und 1 Liter Milli-Q-Wasser
Agar	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. A0930
NaCl	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. S5000
Pepton	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. P3300
Calciumchlorid	USBiologische Lebenswissenschaften
Magnesiumsulfat	Fisher Scientific	M63-500
Phospat-Puffer			Menge pro Liter: 132 mL zweibasisches Kaliumphosphat (1M) und 868 mL monobasisches Kaliumphosphat (1M)
Monobasisches Kaliumphosphat	Acros Organics	7778-77-0
Dibasisches Kaliumphosphat	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. 5100
Bakterielle Stämme
P. aeruginosa (PA14)
E. coli Superfood (OP50)
E. coli RNAi-exprimierende Bakterien (HT115)
Wurm-Stamm
glp-4(bn2) (Beanan und Strome, 1992, PMID: 1289064)