Bewertung der durch pathogene Bakterien induzierten Mortalität bei Larven von C. elegans

Zusammenfassung

Quelle: Anderson, Q. L., et al. Ein Pathosystem von C. elegans mit hohem Durchsatz und hohem Gehalt auf Flüssigkeitsbasis. J. Vis. Exp. (2018)

Das Video zeigt einen flüssigkeitsbasierten Assay, bei dem genetisch veränderte C . elegans-Larven in einer Mikroplatte pathogenen Bakterien ausgesetzt werden. Bakterielle Toxine, die in das Medium ausgeschieden werden, führen zu Stress und Tod des Wirts. Ein Fluoreszenzfarbstoff färbt tote Würmer und ermöglicht so eine bildgebende Quantifizierung der Mortalität, um die genetische Anfälligkeit oder Resistenz zu beurteilen.

Protokoll

1. Aufbau des Liquid Killing Assays (Basisprotokoll)

Anmerkung: Dabei handelt es sich um ein Protokoll für einen Bakterienstamm und eine Quelle von Würmern.

1. Entfernen Sie mit einem Zellschaber den Pseudomonas aeruginosa von einer Slow Killing oder SK-Platte und resuspendieren Sie ihn in ~ 5 mL S Basal. Skalieren Sie bei Bedarf hoch. Messung der optischen Dichte der Bakteriensuspension mit einem Spektralphotometer (OD₆₀₀)
2. Bereiten Sie 24 ml verdünnte Brühe von P. aeruginosa in S Basal bei OD₆₀₀ ≈ 0,09 (3-fache Endkonzentration) vor. Siehe 4.6.2 für den Endgehalt pro Vertiefung und das Volumen der bakteriellen Verdünnung entsprechend skalieren.
3. 21 mL flüssiges Slow Kill Medium (3 g NaCl, 3,5 g Pepton/L, ergänzt mit CaCl₂ und MgSO₄ bis zu einer Endkonzentration von 1 mM) zugeben. Übertragen Sie mit einer Mehrkanalpipette 45 μl Bakterien und Medien in jede Vertiefung einer 384-Well-Platte.
4. Waschen Sie die Würmer von ihrer Quelle in ein konisches 50-ml-Röhrchen und lassen Sie die Würmer sich unter der Schwerkraft absetzen. Überstand auf 5 mL aspirieren. Resuspendieren Sie in insgesamt 50 mL S basal.
5. Wiederholen Sie Schritt 1.4 zweimal.
6. Sortieren Sie mit einem Schneckensortierer ca. 22 Würmer in jede Vertiefung der 384-Well-Platte.
   Anmerkung: Das Setup lässt jeden Wurm in ~1,1 μl Flüssigkeit fallen. 22 Würmer ergeben einen Gesamtgehalt von 25 μl, was das Gesamtvolumen des Assays auf 70 μl/Vertiefung erhöht.
   1. Die endgültige Zusammensetzung jeder Vertiefung besteht aus 70 μL. 45 μl dieses Volumens werden als Bakterienmedium zugegeben (0,03 OD₆₀₀ Bakterien in 24 μL S Basal und 21 μL SK ergänzt mit CaCl₂ und MgSO₄). Die anderen 25 μL werden mit den 22 Würmern hinzugefügt.
   2. Wenn der hier verwendete Sortierer (siehe Materialtabelle) nicht verfügbar ist, können Würmer auf eine Endkonzentration von 1 Wurm/μl in S Basal verdünnt und mit einer Mehrkanalpipette auf 25 μl/Vertiefung pipettiert werden. Die Ergebnisse können jedoch eine erhöhte Variabilität aufweisen. Alternativ ist es möglich, einen peristaltischen Flüssigkeitsspender zu verwenden, wie von Leung und Kollegen beschrieben.
7. Nachdem die Würmer in die 384-Well-Platte einsortiert wurden, verschließen Sie die Platte mit einer gasdurchlässigen Folie und inkubieren Sie die Platten bei 25 °C für 24 - 48 h.
8. Waschen Sie die 384-Well-Platte zum gewünschten Zeitpunkt mit einem Mikrotiterplatten-Wascher insgesamt 5 Mal mit S Basal.
   1. Nach dem zweiten Waschen den größten Teil des Mediums ansaugen und ~20 μl übrig lassen. Schütteln Sie die Platten mit einem Mikrotiterplatten-Vortexer mindestens 30 Sekunden lang kräftig, um Schmutz vom Boden der Vertiefungen zu lösen.
9. Nach der abschließenden Wäsche den Überstand auf 20 μl aspirieren. 50 μl 0,98 μM Nukleinsäurefärbung (siehe Materialtabelle)/Vertiefung der 384-Well-Platte für eine Endkonzentration von 0,7 μM hinzufügen.
10. Bei Raumtemperatur 12 - 16 h inkubieren. Dieser Farbstoff färbt nur tote Würmer ab. Waschen Sie die Platten nach der gewünschten Inkubationszeit mit dem Mikrotiterplatten-Wascher, um überschüssige Flecken zu entfernen (mindestens 3 Wäschen).
11. Verwenden Sie für die Datenerfassung ein Spektralphotometer oder ein automatisiertes Mikroskop, um sowohl das Durchlicht als auch die Fluoreszenz (531 nm Anregung und 593 nm Emission) abzubilden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
COPAS FP BioSorter	Union Biometrica		Durchflusszytometer / Wurmsortierer für große Objekte
Zytation 5	BioTek
EL406 Waschmaschinen-Spender	BioTek
Multitron Pro	Infors HT
24 Deep-Well-RB-Block	Thermo Fisher Scientific	CS15124
384-Well-Platte	Greiner Bio-One	Hersteller-Art.nr. 781091
Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)			Menge pro Liter: 18 Gramm Agar, 3 Gramm NaCl, 2,5 Gramm Pepton, 1 mL CaCl₂ (1 M), 1 mL MgSO₄ (1 M), 25 mL Phospat Puffer und 973 mL Milli-Q Wasser
Slow Killing (SK) Platten			Menge pro Liter: 18 Gramm Agar, 3 Gramm NaCl, 3,5 Gramm Pepton, 1 mL CaCl₂ (1 M), 1 mL MgSO₄ (1 M), 25 mL Phospat Puffer und 973 mL Milli-Q Wasser
Slow Killing (SK) Medien			Menge pro Liter: 3 Gramm NaCl, 3,5 Gramm Pepton, 1 mL CaCl₂ (1 M), 1 mL MgSO₄ (1 M), 25 mL Phosphatpuffer und 973 mL Milli-Q Wasser
Lysogeny-Bouillon (LB)	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. L1520
Brian Heart Infusion Brühe (BHI)	Research Products International Corp	50-488-526
Wurmbleichlösung			Menge pro 100 ml: 10 ml 5 m NaOH-Lösung, 20 ml 5%ige Natriumhypochloritlösung und 70 ml steriles Wasser
S Basal			Menge pro Liter: 5,85 Gramm NaCl, 6 Gramm KH₂PO₄, 1 Gramm K₂HPO₄ und 1 Liter Milli-Q Wasser
Agar	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. A0930
NaCl	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. S5000
Pepton	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. P3300
CaCl₂	USBiologische Lebenswissenschaften
MgSO₄	Fisher Scientific	M63-500
Phospat-Puffer			Menge pro Liter: 132 mL K₂HPO₄ (1M) und 868 mL KH₂PO₄ (1M)
KH₂PO₄	Acros Organics	7778-77-0
K₂HPO₄	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. 5100
5% ige Natriumhypochlorit-Lösung	BICCA	7495.5-32
NaOH-Lösung	Fisher Scientific	SS255-1
Atmen Sie tief durch	Diversifizierte Biotechnologie	BEM-1
SYTOX Orange Nukleinsäure-Färbung	Fisher Scientific	Nr. S11368
Bakterielle Stämme
P. aeruginosa (PA14)
E. faecalis (OG1RF)
E. coli Superfood (OP50)
E. coli RNAi-exprimierende Bakterien (HT115)
Wurm-Stämme
glp-4(bn2) (Beanan und Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP-Reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)