Kultivierung und Pflege von RNAi-exprimierenden Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Anderson, Q. L., et al., Ein Pathosystem mit hohem Durchsatz, hohem Gehalt, flüssig basiertem C. elegans . J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die Vorbereitung von RNA-Interferenz-Bakterien (RNAi), die Plasmide tragen, um die Expression des Zielgens zu hemmen. Es werden die Auswahl-, Wachstums- und Induktionsschritte von RNAi-Bakterien zur Herstellung von dsRNA-exprimierenden Platten für nachgelagerte Assays beschrieben.

Protokoll

1. Vorbereitung von RNA-Interferenzbakterien (RNAi)

1. Streichen Sie gewünschte Stämme von RNAi-haltigen Bakterien aus einem gefrorenen Stamm aus einem gefrorenen Stamm aus oder übertragen Sie sie auf Lysogeny-Broth (LB)-Agarplatten, die geeignete Antibiotika enthalten (Carbenicillin bei 100 μg/ml und Tetracyclin bei 15 μg/ml für Ahringer- und Vidal-Bibliotheken).
   Anmerkung: Wenn Sie mit nichtpathogenen Bakterien arbeiten, verwenden Sie entweder eine biologische Sicherheitswerkbank der Biosicherheitsstufe (BSL)-2 A/B oder eine BSL-1 Laminar-Flow-Haube, um die Sterilität der Kulturen zu gewährleisten und die Wahrscheinlichkeit einer Kreuzkontamination der Bibliothek zu minimieren.
2. Die Platten 24 h bei 37 °C inkubieren.
3. Lagern Sie die Platten bis zu zwei Wochen bei 4 °C.
   1. Entsorgen Sie die Platten nach zwei Wochen und ersetzen Sie sie durch frisch zubereitete Teller.
4. Testen Sie mehrere RNAi-Stämme parallel, indem Sie einzeln eine einzelne Kolonie aus jedem Klon in 4 ml Carbenicillin-supplementiertes LB in einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Deep-Well-Platte oder in ein steriles Reagenzglas inokulieren.  
   Anmerkung: Es wurde berichtet, dass Tetracyclin die Wirksamkeit von RNAi verringert. Verwenden Sie es nicht in diesem Medium.
5. Legen Sie 24-Well-Deep-Well-Platten in einen Schüttelinkubator, der für Multiwell-Platten optimiert ist, und inkubieren Sie 16 Stunden lang bei 37 °C, während Sie bei 950 U/min schütteln. Anmerkung: Mit einem herkömmlichen Schüttelinkubator ist es schwierig, ein gleichmäßiges Bakterienwachstum in Multiwell-Platten zu erzielen. Der Schüttelinkubator muss in der Lage sein, mit mindestens 750 U/min zu schütteln, damit die Kulturen richtig wachsen können. In Ermangelung eines speziellen Schüttlers ist es möglich, jede Kultur in einem einzelnen Röhrchen zu züchten. Die Kulturen können zur anschließenden Zentrifugation in die 24-Well-Platte überführt werden.
6. Sammeln Sie Bakterien, indem Sie 5 Minuten lang bei 2.000 x g zentrifugieren.
7. Dekantieren Sie den Überstand, indem Sie die Platte umdrehen und kräftig schütteln. Resuspendieren Sie RNAi-Bakterien in 100 μl S Basal (5,85 g Natriumchlorid, NaCl; 1 g Dikaliumphosphat, K₂HPO₄; 6 g Monokaliumphosphat, KH₂PO₄ , gelöst in 1 l Reinstwasser und sterilisiert im Autoklaven).
8. Pipettieren Sie resuspendierte Bakterien in eine angemessene Anzahl von Vertiefungen einer Multiwell-NGM-Platte (Nematoden-Wachstumsmedium, 3 g NaCl, 2,5 g Pepton, 1 mM Calciumchlorid, CaCl₂; 1 mM Magnesiumsulfat, MgSO₄; 25 mL Phosphatpuffer (Menge pro Liter: 132 mL K₂HPO₄ (1 M) und 868 mL KH₂PO₄ (1M)) und 18 g Agar pro Liter Wasser), ergänzt mit IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid; 1 mM Endkonzentration) und Carbenicillin (100 μg/ml Endkonzentration).
   1. Verwenden Sie 3,5 ml NGM-Medien pro Vertiefung einer 6-Well-Platte, 1 ml pro Vertiefung einer 24-Well-Platte oder 150 μl pro Vertiefung einer 96-Well-Platte.
   2. Verwenden Sie 100 μl/Vertiefung Bakterien für eine 6-Well-Platte, 50 μl/Vertiefung für eine 24-Well-Platte oder 20 μl/Vertiefung für eine 96-Well-Platte. Trocknen lassen.
      Anmerkung: Die Trocknung erfolgt in der Regel in einer sterilen Strömungshaube, um eine schnelle und gleichmäßige Trocknung zu gewährleisten. Eine gleichmäßige Trocknung ist sehr wichtig. Vermeiden Sie eine Übertrocknung, da Risse im Agar das Eingraben von Würmern begünstigen. Dies führt zu Schneckenverlusten und möglicher Verstopfung von Liquid-Handling-Systemen.
9. Verwenden Sie die vorbereiteten Platten sofort oder lagern Sie sie für eine spätere Verwendung bis zu zwei Wochen bei 4 °C.
   Anmerkung: Um ein Austrocknen der Platten zu verhindern, können sie mit Kunststoffparaffinfolie versiegelt oder in ein dicht verschlossenes Gefäß mit feuchten Papiertüchern gelegt werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
24 Deep-Well-RB-Block	Thermo Fisher Scientific	CS15124
Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)			Menge pro Liter: 18 Gramm Agar, 3 Gramm Natriumchlorid, 2,5 Gramm Pepton, 1 ml Calciumchlorid (1 M), 1 ml Magnesiumsulfat (1 M), 25 ml Phospatpuffer und 973 ml Milli-Q-Wasser
Lysogeny-Bouillon (LB)	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. L1520
S Basal			Menge pro Liter: 5,85 Gramm Natriumchlorid, 6 Gramm Monokaliumphosphat, 1 Gramm Dikaliumphosphat und 1 Liter Milli-Q Wasser
Agar	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. A0930
Natriumchlorid	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. S5000
Pepton	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. P3300
Calciumchlorid	USBiologische Lebenswissenschaften
Magnesiumsulfat	Fisher Scientific	M63-500
Phospat-Puffer			Menge pro Liter: 132 mL Dikaliumphosphat (1 M) und 868 mL Monokaliumphosphat (1 M)
Monokaliumphosphat	Acros Organics	7778-77-0
Dikaliumphosphat	USBiologische Lebenswissenschaften	Nr. 5100