Expression des Lumineszenz-Operons in marinen biolumineszierenden Bakterien

Zusammenfassung

Quelle: Brodl, E., et al. In situ Messung und Korrelation der Zelldichte und Lichtemission von biolumineszierenden Bakterien. J. Vis. Exp. 1 (2018)

Dieses Video zeigt die Kultivierung mariner biolumineszierender Bakterien, um die durch Quorum Sensing vermittelte Aktivierung des Lumineszenz-Operons zu beobachten, was eine Echtzeitüberwachung der Genexpression und Lichtemission für Studien zur mikrobiellen Kommunikation und Genregulation ermöglicht.

Protokoll

1. Expression bakterieller biolumineszierender Stämme

ANMERKUNG: Bakterielle biolumineszierende Stämme benötigen ein spezifisches Wachstumsmedium/künstliches Meerwassermedium für das Wachstum und die Lichtproduktion.

1. Bereiten Sie ein künstliches Meerwassermedium vor, das aus zwei getrennt hergestellten Medienkomponenten besteht.
   ANMERKUNG: Die folgenden Mengen gelten für 1 L flüssiges Medium oder 1 L Agarmedium.
   1. Für das künstliche Meerwassermedium werden folgende Salze eingewogen: 28,13 g NaCl (Natriumchlorid), 0,77 g KCl (Kaliumchlorid), 1,60 g CaCl₂ · 2H₂O (Calciumchlorid-Dihydrat), 4,80 g MgCl₂ · 6H₂O (Magnesiumchlorid-Hexahydrat), 0,11 g NaHCO₃ (Natriumbicarbonat) und 3,50 g MgSO₄ · 7H₂O (Magnesiumsulfat-Heptahydrat).
   2. 1 l destilliertes Wasser hinzufügen und alle Bestandteile auflösen.
   3. Für LB (Luria-Bertani) Medium wiegen Sie folgende Zutaten ein: 10 g Hefeextrakt, 10 g Pepton und für Agarplatten zusätzlich 20 g Agar.
   4. Fügen Sie 250 mL Leitungswasser hinzu und lösen Sie die Komponenten auf.
   5. Beide vorbereiteten Medien separat bei 121 °C für 20 min autoklavieren.
   6. Für Agarplatten direkt nach dem Autoklavieren 250 mL LB-Medium mit 750 mL künstlichem Meerwassermedium mischen und Platten vorbereiten.
   7. Kombinieren Sie für flüssiges Medium 250 mL LB-Medium mit 750 mL künstlichem Meerwassermedium, entweder direkt nach dem Autoklavieren oder nach dem Abkühlen.
      ANMERKUNG: Das künstliche Meerwassermedium kann durch Salzniederschläge trüb werden.
2. Die bakteriellen biolumineszierenden Stämme auf künstliche Meerwasser-Agarplatten streichen und über Nacht bei 24 - 30 °C inkubieren.
   ANMERKUNG: Die Langzeitlagerung von Bakterienstämmen wird in der Regel durch das Einfrieren von Glycerinbeständen der Bakterienkultur erreicht. Die Stämme sollten immer zuerst auf die Agarplatten gestreift werden, um einheitliche Startbedingungen für alle Stämme zu gewährleisten, bevor sie für Flüssigkulturen verwendet werden, da es nach dem Auftauen zu einer Verzögerungsphase des Wachstums kommt.
3. Bereiten Sie eine ONC (Overnight-Kultur) vor, indem Sie 100 ml künstliches Meerwassermedium mit einer einzigen Kolonie von der Platte beimpfen. Inkubieren Sie den ONC bei 24 - 30 °C und 120 U/min in einem Inkubatorschüttler über Nacht.
4. Beimpfen Sie 800 mL künstliches Meerwassermedium mit 8 mL ONC.
5. Inkubieren Sie die Bakterienzellen bei 24 - 30 °C und 120 U/min in einem Inkubatorschüttler.
   ANMERKUNG: Das Lichtintensitätsprofil von biolumineszierenden Bakterien variiert stark mit der Temperatur. Abhängig von den Regulationsmechanismen der Lichtproduktion des jeweiligen Bakterienstammes kann die Lichtemission nach ca. 1 - 6 h einsetzen.
6. Beobachten Sie die Bakterienzellkultur, bis sie zu glänzen beginnt (ca. 1 - 6 h).
   ANMERKUNG: Je nach Zweck der Expression werden die Zellen bis zum nächsten Tag gezüchtet und dann geerntet, oder die Zellen können so lange geschüttelt werden, wie sie glänzen. Die Ernte der Zellen und die Reinigung aller Proteine kann nach Standardverfahren erfolgen.

Materialien