Mikroskopische Analyse des Bakterienwachstums unter Stress mit Hilfe von mikrofluidischen Kammern

Zusammenfassung

Quelle: Cayron, J., et al. Multiskalige Analyse des Bakterienwachstums unter Stressbehandlungen. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt, wie eine mikrofluidische Platte für die Abbildung von Bakterienzellen unter Stressbedingungen vorbereitet und verwendet wird. Es wird der Prozess der Einführung einer Bakterienkultur und eines stressinduzierenden antibiotischen Mediums beschrieben, gefolgt von der Zellbeladung und dem mikroskopischen Aufbau. Mit Hilfe der Zeitraffer-Bildgebung im Phasenkontrastmodus wird dann die Entwicklung von länglichen, filamentösen Zellen mit erhöhtem DNA-Gehalt aufgrund der gehemmten Zellteilung beobachtet.

Protokoll

1. Mikrofluidik Zeitraffer-Mikroskopie Bildgebung
   1. Nehmen Sie die Konservierungslösung von der mikrofluidischen Platte und ersetzen Sie sie durch frisches, auf 37 °C vorgewärmtes Medium, wie in der Bedienungsanleitung der mikrofluidischen Software beschrieben.
   2. Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte mit dem Verteilersystem und klicken Sie auf die Schaltfläche Ansaugen.
   3. Legen Sie die Mikrofluidikplatte mit dem Verteilersystem auf den Mikroskoptisch und heizen Sie sie ~2 h lang bei 37 °C vor, bevor Sie mit der Mikroskopieaufnahme beginnen.
      ANMERKUNG: Dieser Vorwärmschritt ist entscheidend, um eine Erweiterung der mikrofluidischen Kammer zu vermeiden, die die Fokussierung des Mikroskops während des Zeitrafferexperiments verändern und die Bildaufnahme beeinträchtigen würde.
   4. Versiegeln Sie die mikrofluidische Platte. Ersetzen Sie das Medium aus Vertiefung 8 durch 150 μl Kulturprobe und ersetzen Sie das Medium von Vertiefung 1 bis 5 durch das gewünschte Medium mit oder ohne das stressauslösende Reagenz.
   5. Verschließen Sie die mikrofluidische Platte und legen Sie sie auf den Mikroskoptisch.
   6. Führen Sie auf der mikrofluidischen Software den Zellladevorgang aus. Überprüfen Sie, ob die Beladung der Zellen zufriedenstellend ist, indem Sie unter dem Mikroskop im Durchlicht schauen. Führen Sie den Zellladevorgang ein zweites Mal durch, wenn die Zelldichte in der Kammer nicht ausreicht.
   7. Führen Sie im Durchlichtmodus eine sorgfältige Fokussierung durch und wählen Sie mehrere Sichtfelder aus, in denen isolierte Bakterien angezeigt werden. Es ist wichtig, Felder auszuwählen, die nicht überfüllt sind, um das Wachstum der isolierten Zellen im Laufe der Zeit überwachen zu können (empfohlen werden ~10–20 Zellen pro 100 μm²). Dies wird auch die Zellerkennung bei der Bildanalyse erleichtern.
   8. Klicken Sie in der Mikrofluidik-Software auf die Schaltfläche Protokoll erstellen. Programmieren Sie die Injektion des Wachstumsmediums für 1-2 Generationszeitäquivalente, damit sich die Zellen anpassen können (optional). Programmieren Sie dann die Injektion des stressauslösenden Mediums während 10 Minuten bei 2 psi, gefolgt von der Injektion bei 1 psi für die gewünschte Dauer der Stressbehandlung. Wenn Sie beabsichtigen, die Erholung der Zellen nach Stress zu analysieren, programmieren Sie die Injektion von frischem Wachstumsmedium für die gewünschte Dauer.
      ANMERKUNG: In dem hier vorgestellten Experiment wurde Cephalexin für 10 min bei 2 psi injiziert, gefolgt von 50 min bei 1 psi. Dann wurde frisches Wachstumsmedium bei 2 psi für 10 min injiziert, gefolgt von 3 h bei 1 psi.
   9. Führen Sie die Mikroskopie-Bildgebung im Zeitraffermodus mit 1 Bild alle 10 Minuten unter Verwendung des Phasenkontrasts im Durchlicht und einer 560-nm-Anregungslichtquelle für das mCherry-Signal durch, falls erforderlich.
      ANMERKUNG: Es ist wichtig, die mikroskopische Bildaufnahme gleichzeitig mit dem Start des mikrofluidischen Injektionsprotokolls zu beginnen.

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