Beurteilung des Bakterienschwarms mit einer Gradientenhemmerplatte

Zusammenfassung

Quelle: Guo, S., et al. Quantifizierung der Motilität des bakteriellen Oberflächenschwarms auf Induktorgradientenplatten. J. Vis. Exp. (2022).

Dieses Video zeigt die Verwendung einer doppellagigen Gradientenschwarmplatte, um das Schwarmverhalten von Bakterien unter unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen zu untersuchen. Eine Platte mit einem gradientenbildenden Inhibitor in der unteren Schicht wird mit Bakterien beimpft und inkubiert. In regelmäßigen Abständen werden Bilder aufgenommen, um die Wirkung der Inhibitorkonzentration auf das Bakterienschwärmen zu analysieren.

Protokoll

1. Vorbereitung der Gradientenschwarmplatten

1. Vorbereitung des Schwarmmediums
   HINWEIS: In diesem Protokoll wurde eine Agarkonzentration von 0,7 % (w/v) des Schwarmmediums verwendet.
   1. Lysogeny-Bouillon (LB) -Pulver mit Agar in zwei konischen Kolben zubereiten; Jeder Kolben enthält 2 g Trypton, 2 g Natriumchlorid (NaCl), 1 g Hefeextrakt und 1,4 g Agar. Fügen Sie doppelt destilliertes Wasser (ddH₂O) hinzu und rühren Sie die Suspension mit einem Magnetrührstab um. Stellen Sie das endgültige Volumen auf 200 mL ein, indem Sie zusätzliche ddH₂A hinzufügen.
   2. Die Lösung 20 min lang bei 121 °C autoklavieren. Verwenden Sie einen luftdurchlässigen Verschluss oder eine Flaschenversiegelungsfolie mit Entlüftungsöffnung.
      HINWEIS: Agar löst sich auf, wenn es im Autoklaven erhitzt wird.
   3. Wenn die Temperatur auf 65 °C sinkt, mischen Sie die Lösung, um die Homogenität zu gewährleisten, und geben Sie das Medium für den kurzfristigen Gebrauch in einen 65 °C-Inkubator oder ein Wasserbad.
2. Aufbereitung des Schwarmmediums der unteren Schicht
   HINWEIS: Das Medium der unteren Schicht ist das Gemisch aus Schwarmmedium und Induktor-Stammlösungen. Die Formulierung von Induktorgradienten-Schwarmplatten ist in Tabelle 1 dargestellt.
   1. Bereiten Sie eine 100 mM Resveratrol-Stammlösung vor, indem Sie 114,12 mg lyophilisiertes Resveratrol-Pulver in 5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen und die Lösung bei -20 °C lagern.
   2. Bereiten Sie eine 20%ige (w/v) Arabinose-Stammlösung vor, indem Sie 6 g Arabinosepulver in 30 ml ddH₂O auflösen; Warten Sie 10-15 Minuten, damit sich die Arabinose auflösen kann; und lagern Sie die Lösung bei Raumtemperatur.
   3. Nehmen Sie das Medium aus dem 65 °C-Inkubator und stellen Sie es auf Raumtemperatur. Lassen Sie das Schwarmmedium abkühlen, bis der Erlenmeyerkolben kühl genug ist, um ihn aufzunehmen (~50 °C). Stellen Sie das Schwarmmedium nicht über längere Zeit bei Raumtemperatur auf, da dies zur Verfestigung des Agars führt.
   4. Das erforderliche Volumen der Induktor-Stammlösung wird dem Schwarmmedium bei 50 °C zugegeben (Tabelle 1). Verwenden Sie eine Pipette, um die Induktorlösung abzugeben, anstatt sie zu gießen. Vorsichtig schwenken, um den Induktor mit dem Schwarmmedium zu vermischen.
      HINWEIS: Dieser Schritt gilt für Induktoren, die nicht autoklaviert werden können. Achten Sie darauf, keine Blasen in das Medium zu bringen.
3. Vorbereitung von doppellagigen Gradienten-Schwarmplatten
   HINWEIS: Das Medium der oberen Schicht ist LB-Medium mit 0,7 % (w/v) Agar.
   1. Beschriften Sie 13 x 13 cm große quadratische Petrischalen mit dem Namen und den Stämmen des Induktors und stützen Sie die Schalen über den Rand der Deckel (Abbildung 1B).
   2. Geben Sie 40 mL warmes Medium der unteren Schicht (50 °C) mit einer 50 mL Pipette oder einem 50 mL Zentrifugenröhrchen hinzu.
      HINWEIS: Alternativ eignet sich für quadratische Petrischalen von 13 x 13 cm das Medium der unteren und oberen Schicht mit 40 mL; für 10 x 10 cm quadratische Petrischalen ist 25 mL Unterschicht und Oberschicht Medium geeignet.
   3. Lassen Sie das Medium der unteren Schicht 1 h lang unbedeckt in einer Laminar-Flow-Haube aushärten. Stören Sie die quadratischen Petrischalen nicht, während sich das Medium verfestigt.
      HINWEIS: Während der Aushärtung der unteren Schicht sollte das Schwarmmedium, das keine Induktoren enthält, in einem 65 °C heißen Inkubator oder Wasserbad aufbewahrt werden.
   4. Sobald die untere Schicht vollständig erstarrt ist, entfernen Sie die Deckel und stellen Sie die quadratischen Petrischalen in eine Laminar-Flow-Haube.
   5. 40 ml warmes Medium der oberen Schicht (50 °C) mit einer 50-ml-Pipette oder einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen hinzufügen.
      HINWEIS: Das Medium der oberen Schicht enthält keine Induktoren.
   6. Härten Sie die Doppelschichtplatten abgedeckt und ungestört 1 h lang auf der Arbeitsplatte aus. Lagern Sie die vorbereiteten Platten bis zu 24 h bei 4 °C.HINWEIS: Längere Aushärtungszeiten würden den Feuchtigkeitsgehalt verringern und die Motilität des Schwärmens einschränken.

2. Wachstum von E. coli K12 und P. aeruginosa PAO1

1. Bereiten Sie 500 ml LB-Medium vor, indem Sie 5 g Trypton, 5 g NaCl und 2,5 g Hefeextrakt in ddH₂O hinzufügen und die Lösung auf 500 ml auffüllen. Die Lösung wird 20 Minuten lang bei 121 °C im Flüssigkeitskreislauf autoklaviert und bei 4 °C gelagert.
2. Bereiten Sie 100 ml 1,5 % (w/v) LB-Agar-Medium vor, indem Sie 1 g Trypton, 1 g NaCl, 0,5 g Hefeextrakt und 1,5 g Agar in ddH₂O hinzufügen und die Lösung auf 100 ml auffüllen. Autoklavieren Sie die Lösung 20 Minuten lang bei 121 °C im Flüssigkeitskreislauf. Übertragen Sie das Medium in ein 50 °C warmes Wasserbad, um ein Erstarren des Agars zu verhindern.
3. Wenn der LB-Agar-Medium-Kolben gut in der Hand liegt, geben Sie 20 ml LB-Agar-Medium mit einer 25-ml-Pipette in eine Petrischale (10 cm Durchmesser). Lassen Sie die Platte über Nacht bei Raumtemperatur stehen und lagern Sie die LB-Agar-Platte bei 4 °C.
4. Bestandskulturen, die bei -80 °C gelagert wurden, streifen E . coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 und P. aeruginosa PAO1-YdeH-Stämme auf LB-Agar-Petrischalen unter Verwendung von Einweg-Impfösen. Inkubieren Sie die Petrischalen über Nacht bei 37 °C.
5. Entnehmen Sie einzelne Kolonien für verschiedene Stämme aus den Petrischale, inokulieren Sie jede Kolonie in 5 ml LB-Medium und inkubieren Sie die Kultur bei 37 °C in einem Labororbitalschüttler mit 220 U/min.
6. Wenn die Kulturdichte OD600 nm ~ 1,0 erreicht, nehmen Sie die Kultur aus dem Shaker und stellen Sie sie bei Raumtemperatur auf. Stellen Sie die Kulturdichte auf OD600nm = 1,0 ein, wie in Schritt 3.2.1 beschrieben.

3. Inokulation und Inkubation von Gradientenschwarmplatten

1. Vorbereitung der Impfvertiefungen
   HINWEIS: Anstelle der unten beschriebenen Methode können 3D-Druckabdeckungsmodelle verwendet werden, die in der Lage sind, Vertiefungen zu erzeugen, die durch einen Standardabstand getrennt sind.
   1. Markieren Sie die Vertiefungspositionen auf A4-Papier, wie in Abbildung 1C gezeigt. Stellen Sie drei Testkonzentrationen in einer quadratischen Petrischale mit zwei oder drei Replikaten ein.
   2. Legen Sie das markierte A4-Papier unter eine verfestigte Farbverlaufsplatte. Schieben Sie die breitere Seite einer 100-μl-Pipettenspitze an der markierten Position in die halbfeste Mediumoberfläche. Drücken Sie die Pipettenspitze, bis sie den Boden des Mediums der oberen Schicht erreicht.
   3. Wenn die Spitze den Boden berührt, üben Sie keine vertikale Kraft auf die Spitze aus. Drehen Sie die Spitze vorsichtig, um den Inhalt der zylindrischen Vertiefung zu isolieren.
   4. Bewegen Sie die Pipettenspitzen horizontal in einem sehr kleinen Abstand, um den Luftstrom in den schmalen Raum zu ermöglichen. Drücken Sie mit dem Zeigefinger auf die Spitze, um den Gasfluss in der Spitze zu blockieren, während Sie die Pipette mit Daumen und Mittelfinger halten.
   5. Ziehe die Spitze senkrecht heraus und behalte den Kerninhalt in der Spitze, während du sie herausziehst.
      HINWEIS: Wenn der Inhalt der Vertiefung verrutscht, üben Sie mit dem Zeigefinger etwas mehr Druck aus, um die Spitze vollständig zu verschließen.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2 bis 3.1.5 an jeder markierten Stelle. Decken Sie die Schwarmplatte vor der Inokulation ab.
2. Gradientenplatten-Inokulation und Inkubation
   1. Passen Sie die Wachstumskulturdichte über Nacht auf OD600 nm = 1,0 an.
   2. Pipettieren Sie 80 μl der Übernacht-Wachstumskultur in jede Vertiefung. Verschütten Sie die Bakterienkultur nicht außerhalb der Vertiefungen.
   3. Wickeln Sie die Platten mit Siegelfolie ein. Für eine Langzeitbeobachtung (3-5 Tage) wickeln Sie die Platten mit sterilem Laborgummiband ein.
      HINWEIS: Es ist weniger wahrscheinlich, dass Gummiband reißt.
   4. Stellen Sie ein mit ddH₂O gefülltes Becherglas in den Inkubator, um die Feuchtigkeit im Inkubator zu halten. Die Gradientenschwarmplatten werden bei 37 °C inkubiert.
      HINWEIS: Inkubieren Sie die Schwarmplatten nicht auf dem Kopf; Dies führt dazu, dass die Bakterienkultur aus den Vertiefungen austritt.
   5. Stellen Sie sich die Schwarmplatte unmittelbar nach der Inokulation vor und notieren Sie dies als 0-h-Zeitpunkt.

4. Bildgebung des Schwärmens von bakteriellen Oberflächen

1. Nehmen Sie die Schwarmplatten alle 12 Stunden nacheinander aus dem Inkubator, halten Sie die Platte waagerecht und legen Sie sie in das Gel-Imaging-System (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Hinterlassen Sie keine Fingerabdrücke auf der Oberfläche der Platten. Halten Sie die Seite der Schwarmplatte mit sauberen Handschuhen fest.
2. Wählen Sie den Gel-Imaging-Modus ; Setzen Sie die Schwarmplatte weißem Licht aus. und passen Sie die Brennweite an, um die klarste Sicht auf Schwärme zu erhalten.
   HINWEIS: Verwenden Sie für alle Platten in einer bestimmten Charge die gleiche Brennweite.
3. Verbessern Sie die Helligkeit der Schwärme für eine klare Beobachtung, indem Sie die Belichtungszeit auf 300 ms einstellen. Passen Sie den Schwellenwert an, um Interferenzen durch das Hintergrundlicht zu minimieren.
   HINWEIS: Der Schwellenwert wird auf der Bedienoberfläche des Gel-Imaging-Systems eingestellt. Erhöhen Sie die Werte auf der linken Seite, um Interferenzen durch Hintergrundlicht zu minimieren. Verringern Sie die Werte auf der rechten Seite, um die Helligkeit der Schwärme zu erhöhen. In diesem Protokoll liegt die Region in der Regel zwischen 6.000 und 50.000.
4. Speichern Sie die Bilddatei für die weitere Analyse. Zeichnen Sie die Bildgebungszeit, den Induktortyp, die Gradientenausrichtung und die Dehnungen in einer .txt Datei auf.

 

Tabelle 1: Spezifikationen für Doppelschicht-Schwarmmedium.

Medium der oberen Schicht/Lysogene Bouillon Medium (pro 100 mL)
Trypton: 1 g
Natriumchlorid: 1 g
Hefe-Extrakt: 0,5 g
Agar: 0,7 g
Medium der unteren Schicht/Induktor-haltiges Medium (pro 100 mL)
Trypton: 1 g	Arbeitsschwerpunkt:	Konzentration der Stammlösung:
Natriumchlorid: 1 g
Hefe-Extrakt: 0,5 g	- Resveratrol: 400 μM	- Resveratrol: 100 mM
Agar: 0,7 g
Induktor:	- Arabinose: 0,5 % (w/v)	- Arabinose: 20% (w/v)
- Resveratrol-Stammlösung: 400 μL	oder 1% (w/v)
- Arabinose-Stammlösung: 2,5 mL oder 5 mL

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Vorbereitung, Inokulation und Inkubation von Induktorgradienten-Schwarmplatten. (A) Wachstum der Bakterienkultur über Nacht bei 37 °C. (B) Arbeitsablauf der Doppelschicht-Induktorgradienten-Schwarmpl...

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